同源重组基因编辑技术（独家基因治疗载体AAV）

近日，一项发表在 Nature Biotechnology 杂志上的研究报告受到众多媒体的关注，在一项针对患有血友病的狗接受 AAV 基因疗法的十年研究中，研究人员发现 AAV 病毒携带的治疗性基因片段有些被整合到了狗的染色体上控制生长的基因附近，有诱发癌症的可能性。

图｜该项研究论文（来源：Nature Biotechnology）

“安全神话破灭”、“晴天霹雳” 等词汇出现在诸多文章中，但事实果真如此吗？生辉联系采访了多名病毒学教授、基因治疗教授和相关创业者，他们分享了各自的看法。

前景可期，但需长期监测

首先，我们来回顾一下本次研究的内容。

在此项研究中，研究人员用 AAV 基因疗法治疗 9 只 A 型血友病犬，并随访长达十年时间。通过 AAV 载体递送的治疗基因会合成一种叫作凝血因子 VIII（AAV-cFVIII）的蛋白。研究人员发现，AAV 治疗能够有效改善狗的血友病症状，其中 7 只犬在治疗后成功稳定地产生凝血因子 VIII，令人振奋。

图｜AAV-cFVIII 在患有血友病的犬体内的长期表达（来源：上述论文）

但是，有 2 只犬的凝血因子 VIII 活性水平在治疗后约 4 年开始逐渐增加，在研究快结束时达到了早期水平的 3 倍多。在对其中 6 只接受治疗的犬的肝脏样本中的整合位点进行分析时发现了 1741 个独立的 AAV 整合事件，其中 44% 的整合位点在参与细胞生长的基因附近。

此外，有 5 只犬的某些肝脏细胞分裂得比其他细胞更快，并形成子细胞团块，存在扩增的细胞克隆。

因此，研究人员认为，研究数据表明 2 只犬体内凝血因子 VIII 表达的增加，可能是由于携带整合载体的细胞克隆扩张所致。他们认为，这项研究结果虽然支持了血友病 A 肝靶向 AAV 基因治疗的临床前景，但仍有必要对接受 AAV 载体治疗的患者开展进一步研究和长期监测。

“插入致癌”、“基因整合”、“需长期监测”，表述略显触目惊心。但事实上，这并不是首次出现 AAV 载体有可能诱发癌症的报道，甚至在今年已经出现了 4 例在 AAV 基因治疗临床试验中去世的患者。

图｜今年 1 月份关于 AAV 病毒有致癌风险的报道（来源：Science）

早在今年 1 月，Science 上发表的一篇报道就表示，这项针对狗的血友病的新研究表明，AAV 病毒可以轻易将其携带的基因插入到宿主的 DNA 中，并且插入位置靠近调控细胞生长的基因，有诱发癌症的可能性。

“太炒作了”

接二连三的报道，让这个安全性被广泛认可的病毒载体受到许多质疑，AAV 基因疗法在安全性上真的存在致命缺陷吗？

“这不是意料之中的吗？” 香港大学病毒学专家金冬雁直言不讳地笑答道。

“AAV 载体属于整合型载体，它本来就是会整合的。当复制酶（replicase）存在时会特异性地整合到 19 号染色体的特定位置，但是复制酶本身有细胞毒性，会造成细胞停止生成，也就是说在抑制细胞生长的同时还有细胞毒性。如果把复制酶去掉，AAV 的整合又开始具有随机性，和逆转的病毒相近。过去逆转录病毒和慢病毒载体都发生类似的情况，所以这并不是有什么意外，也不是‘晴天霹雳’、‘神话破灭’，这太过煽情。”

图丨金冬雁

金冬雁透露，早年间已经有关于 “AAV 整合致癌” 等类似研究论文发表，他认为，凡是整合就会有这个问题，但金冬雁反复强调，绝对不能说这是 AAV 载体的 “末日”。

“太炒作了”，金冬雁说，“继续做基础研究，这些是完全可以克服的。像过去逆转录病毒载体，经过好几代的优化，很多问题也都解决了。”

丹麦奥胡斯大学基因治疗专业博士、上海交通大学教授、上海本导基因技术有限公司创始人蔡宇伽始终在从事病毒载体及非病毒载体相关的研究，他也为生辉梳理了基因治疗中 AAV 整合事件的历史。

“早在 2007 年， Science 上有篇文章就讲了 AAV 整合诱发肝癌现象。当时用的是小鼠模型，这次 Nature Biotechnology 的研究是大动物模型，说服力就会更好一些。” 蔡宇伽说。

图丨 50 年 AAV 发展线（来源：Nature Reviews Drug Discovery）

针对本项研究，蔡宇伽强调，“研究表明，AAV 整合到相关基因的附近并且导致了克隆扩增，我认为这是一个值得警觉的信号，不能无视。2000 年初，有 9 位免疫缺陷症患者接受了以逆转录病毒为载体的基因治疗，其中 4 位患者由于逆转录病毒整合到癌基因附近，导致癌基因的激活并诱发了白血病。正是因为这个事件，基因治疗陷入了低谷期。从宏观的角度上讲，基因治疗发展的历史就是在挫折当中前进，我觉得不应该因噎废食，但也不能无视风险。”

图丨蔡宇伽

而中科院生物化学与细胞生物学研究所博士、麻省理工学院 Whitehead 研究所博士后、辉大（上海）生物科技有限公司联合创始人、首席科学顾问杨辉在阅读过论文研究后告诉生辉，这些标题连断章取义都算不上，因为文章完全没有这样的结论，“文章证明了 AAV 治疗的长期有效性，又强调长期监测基因安全的重要性。”

• “These results support the clinical development of liver-directed AAV gene therapy for hemophilia A, while emphasizing the importance of long-term monitoring for potential genotoxicity.”—— 论文中的结论性观点表达

针对论文中 “检测发现其中 6 只接受治疗的狗的肝脏组织中发现了 1741 个独立的 AAV 整合事件，其中 44% 的整合位点在参与细胞生长的基因附近” 这一情况，杨辉认为，肝脏细胞本身就有一定的增殖能力，而且还有多倍体的存在，所以有一点高估了 AAV 导致的细胞增殖能力变强。此外，感染了凝血因子 Ⅷ 的细胞本身就比凝血因子缺陷的细胞多一些生长优势。所以，经过十年的长期观察检测到 44% 的 AAV 整合位点在参与细胞生长的基因附近也可以理解。

但对于致癌性的情况，杨辉给出了与金冬雁不同的观点。“目前还没有确定 AAV 致癌的报道，一来 AAV 整合到基因组的概率本身就是所有病毒载体里面最低的，二来即便经过十年时间，所有肝功能指标都正常。这一现象究竟是 AAV 整合导致的，还是肝脏本身正常的增殖现象，还是感染凝血因子 Ⅷ 的细胞的生长优势都还无法下定论，还需要更多更深入的研究。”

与杨辉提出相同看法的还有基因治疗 CDMO 公司和元生物技术（上海）股份有限公司总经理贾国栋。贾国栋说：“原文意思可能被曲解了。原文只是呼吁需要关注长期毒性，一定程度上的整合反而有助于 AAV 基因治疗长效起作用。7/9 的动物有长期稳定的凝血因子 VIII 表达，这对于临床上的基因治疗成药性是个令人振奋的消息。另外，癌变是突变基因的积累带来的，不是说影响细胞增殖就一定致癌。原文也是在部分动物上发现了长期的结果，所以还需要进一步深入的实验才能判断。”

面对风险，如何解决？

在疑似炒作噱头之下，我们又该如何正确对待 AAV 的风险问题？

金冬雁从科研的角度给出了自己看法：“AVV 载体有继续提升、改进的空间，必须要做基础研究。但整个中国做载体研究的人少之又少，个个都去做一些‘花里胡哨’的应用。你看腺病毒载体，也很少有人去做相关的基本研究和生产，我认为就算是做公司，也是需要有强大的基础研究背景，要把 AAV 的病毒学原理吃透了，然后再把插入性突变致癌解决。”

从事病毒研究的蔡宇伽也给出了类似的观点，“金教授的观察非常准确。大家现在默认 AAV 是绝对安全、完美的，这其实并不准确，AAV 远非完美，还有很多可以改进的地方，静下心来做基础性研究很有必要；另一方面，目前基因治疗的技术也非常多，国内公司也可以开发迭代的载体技术。”

在技术层面，该如何做出优化和改进？杨辉认为，对于基因编辑介导的基因治疗来说，并不需要长期基因编辑工具的表达。“所以新的递送工具，比如脂质体、纳米颗粒等，递送 mRNA 或者蛋白到体内各个组织器官成为现在的研究热点，很好地避免了基因整合的问题，以及基因编辑工具长期表达造成的脱靶问题。”

图丨杨辉

从事 AAV 工业化生产的贾国栋则认为，控制 AAV 整合需要从原理上去了解 AAV 整合机制，目前已知的整合是依赖于 Rep 基因，人工改造的 AAV 已经删除了 Rep 基因，所以原则上是安全的，至于仍发生的整合可能是随着时间发展而发生的随机事件，这种从原理上不清晰的问题比较复杂。“我们认为改进的方式是剂量。从原文上看，动物注射的 AAV 病毒量较大，最高剂量 4×10^13 / KG 的动物整合数量最多，这可能意味着病毒使用量与整合的关系。而目前的临床试验中，很多剂量只有 10^11-10^12，1 × 10^13 / KG 的用量已经是高剂量组了，所以可能问题不大。未来，我们也在致力于开发更高效率的 AAV 载体，让患者可以使用更低剂量，提高安全性。”

这一发现对中国的基因治疗产业产生负面的舆论影响吗？

蔡宇伽认为，宏观来看不会对整个行业产生负面的影响。和杨辉的看法类似，蔡宇伽也认为因为目前可选择的基因治疗载体和技术也好都非常多样化，但对 AAV 行业确实有一定的影响，特别是对 AAV 靶向肝脏、AAV 递送 CRISPR 的应用。

持同样观点的还有苏州博腾生物制药有限公司 CTO 孔令洁，“估计不会对基因治疗产生太大的负面影响，但对于目前的一些疾病，如血友病等可能会产生影响，FDA 有可能会格外标注，但对大多数遗传病影响不会太大。”

国内 CRISPR 基因治疗公司的相关人士从产品应用的角度告诉生辉，学术界并不代表工业界的水平，判断一个病毒是否有不良作用，关键要看是它是当成实验用品还是药物用品看待，二者的生产质量控制的各项指标是完全不同的。该人士认为，关于文中提到的整合，从机制上来说，作为一个递送工具来说有几个比较关键的点，第一，一定要降低免疫源性，避免人体中和抗体对它的清除；第二，必须要有非常高的组织特异性，才能够把病毒内的核酸正常递送到组织细胞的表面；第三，转导率，病毒的转导率取决于递送内容有多少能够进到细胞内部。

“这些是病毒载体所完成的最重要的内容。至于病毒所递送的核酸内容物，和这个研究的关联性比较大。第一种情况，如果想要表达一个蛋白，那么在分子元件设计中包含 Promoter（启动子），只需要表达它就可以了，不需要去整合到基因组上，例如以前 Spark 和诺华生产的产品都是表达为主；如果想整合到基因组上并希望把它内源性表达，那么就取决于启动子的设计是否最优，所以高校研究中的设计和公司花费几亿美元所做的事情完全不处于同一水准线上。例如，Spark 的 Hemophilia A 管线进展虽然没有 BioMarin 快，但从临床数据上看，BioMarin 的产品注入体内后，两年内的表达能力持续走低，但 Spark 的产品刚注入体内后，它的拷贝数据虽然没那么高，但却实现持续性增长。”

他认为，这说明对于整合效率来说启动子的设计非常关键，“虽然它的整合带有一定的随机性，但是利用 CRISPR 会更定点，CRISPR 的整合效率不如 AAV 高，所以就需要企业在高效性和安全性之间作出权衡。”

而杨辉乐观地认为，“这篇文章的提出的结论让我们对 AAV 的长期疗效和长期安全性充满信心，应该会促进投资人对基因治疗产业的投入。对于 RNA 编辑介导的基因治疗，其依托 AAV 递送的长期疗效也得到了保证。但是对于 DNA 编辑介导的基因治疗，大家目前更多的关注点在于开发出独立与 AAV 之外的、瞬时的递送方式。”

图丨贾国栋

贾国栋的看法与杨辉类似，“我认为这对基因治疗产业是有很好的促进和正向作用的，首先，这个实验提醒了大家对基因治疗安全性的考量，能够更健康地进行基因治疗项目开发；其次，这个实验把 AAV 载体的开发提到了很重要的位置上，这是基因治疗‘卡脖子’的技术，也是包括和元在内的全球顶级基因治疗载体开发公司致力破解的课题，我们希望能够有更多的用量更低、效果更强的载体被筛选；再次，这个实验针对的肝脏主要是血友病赛道，由于针对的是可分裂细胞，所以有潜在隐患，未来基因治疗的很大一部分工作是针对终末分化的肌肉细胞、神经元进行操作，在这些不分裂细胞上，这个问题不会有太大的安全隐患，所以综合起来会让这个领域更健康稳定发展，会留下真正有技术核心的企业推动治疗落地。”

正如上述嘉宾提出的共同看法，没有任何一个事情是完美的，这一研究结果的客观性值得尊重，但它并不能阻碍技术的进步，基因治疗需要被理性看待。

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