使用显微镜的步骤（显微镜的使用）

按原理分类: 光学显微镜、电子显微镜、偏光显微镜、数码显微镜。

而今天小编给大家介绍的是光学显微镜，并通过几个简单的实验来进一步了解其功能。下图为显微镜的各部分的细节说明，安装时也要注意。

显微镜细节图

通过使用高倍显微镜观察细胞结构来了深入了解显微镜的使用方法，如下短片观察植物细胞内的叶绿素。

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为什么光学显微镜的分辨极限大约是0.2微米

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如上面的简图所示，紫色箭头表示的物体 PQ 经过物镜等之后在相机上成像为P'Q'。由于光的衍射，物体上的点如 P、Q，在相机上并不是单独的点，而是一个个有一定大小的斑，被称为夫琅禾费衍射斑（或称艾里斑），如右侧的同心圆所示。那么，当 P'、Q' 相距太近的时候，两个斑会叠加导致难以分辨。这就要求物体上的 P、Q 要相距一定的距离。

普遍认为最小分辨距离 = 可见光的波长 / 数值孔径.求出来的极限数值是 阿贝极限

但是决定本质的还是分辨率，分辨率不够高把一个像再放大多少倍也没用

1873 年，德国物理学家、卡尔蔡司公司的恩斯特·阿贝（Ernst Abbe）首次推算出衍射导致的分辨率极限。根据瑞利判据——"当一个像斑的中心落到另一个像斑的边缘时，就算这两个像刚好能被分辨"，显微镜能分辨的物体上两点 P、Q 的最小距离 h 为：

这个公式就是光学显微镜的分辨率公式，或称为光学衍射极限。（注意此处的分辨率与通常说的显示器分辨率含义不同）

其中λ为光的波长，n 为物方的折射率，θ为物体与物镜边缘连线和光轴的夹角。如上图所示。为方便起见，其中的通常称为数值孔径，简写为 NA。

摄影领域常用 f/# 或称光圈值来描述镜头，光圈值与数值孔径可以相互换算。对于一枚光圈为 2.0 的镜头来说，数值孔径为 0.25，其分辨能力约 1.2 微米。

目前常用的高倍物镜 NA 最大为1.49，可以算出，对于可见光，比如波长 500 纳米的绿光，显微镜的分辨率约为 200 纳米。所以，即使再提高物镜的放大倍率，也不能提高显微镜的分辨率。

而 200 纳米这个数值也就通常被称作衍射极限。

所以，低于200Nm的通常我们会用电子显微镜（无色）来扫。

光学显微镜的分辨极限大约是0.2微米，相当于放大倍数1500~2000倍；要想实现更大的放大倍数，就得使用电子显微镜或者隧道扫描显微镜。

放大镜可以使光线重新聚焦，从而实现放大效果，使用放大镜的组合可以得到光学显微镜；光学显微镜的极限受波长限制，不可能无限放大。

一般地，固定波长的光学显微镜分辨极限，是光线波长的一半，可见光波长400~760nm之间，所以光学显微镜的分辨极限就是200nm（0.2微米）。小于0.2微米的物体，光学显微镜将无法分辨，就好比人手的触感分辨率，不能超过触感细胞之间的最小距离一样。

而放大倍数是主观的说法，定义为明视距离25cm时，人眼看到的物体大小和实际大小的比值，光学显微镜0.2微米的分辨率，相当于放大倍数1500~2000倍，这足够让我们看清楚一般细胞的结构。

如果我们使用波长更短的电磁波，可以实现更大的放大倍数，但是这已经超出了可见光的波长范围；在1931年，英国物理学家卢斯卡发明了电子显微镜，根据波粒二象性原理，电子束具有更短的德布罗意波波长，所以能实现更小的分辨率。

电子的加速电压和自身波长对应，当电压在100千伏时，电子束波长大约是0.004nm（实际分辨率只能达到0.2nm），也远远小于可见光的波长，所以电子显微镜的分辨极限远超光学显微镜，最大可以实现300万倍的放大倍率，可以分辨病毒、线粒体、DNA等微小物体。

光学显微镜由目镜，物镜，粗准焦螺旋，细准焦螺旋，压片夹，通光孔，遮光器，转换器，反光镜，载物台，镜臂，镜筒，镜座，聚光器，光阑组成

通常皆由光学部分、照明部分和机械部分组成。无疑光学部分是最为关键的，它由目镜和物镜组成。早于1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。光学显微镜的种类很多，主要有明视野显微镜（普通光学显微镜）、暗视野显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、偏光显微镜、微分干涉差显微镜、倒置显微镜。

发展简史

早在公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。

1590年，荷兰Z·Jansen(詹森)和意大利人的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。

1611年，Kepler(克卜勒)：提议复合式显微镜的制作方式。

1665年，R·Hooke(罗伯特·胡克)：「细胞」名词的由来便由胡克利用复合式显微镜观察软木的木栓组织上的微小气孔而得来的。

1674年，A·V·Leeuwenhoek(列文虎克)：发现原生动物学的报导问世，并于九年后成为首位发现「细菌」存在的人。

1833年，Brown(布朗)：在显微镜下观察紫罗兰，随后发表他对细胞核的详细论述。

1838年，Schlieden and Schwann(施莱登和施旺)：皆提倡细胞学原理，其主旨即为「有核细胞是所有动植物的组织及功能之基本元素」。

1857年，Kolliker(寇利克)：发现肌肉细胞中之线粒体。

1876年，Abbe(阿比)：剖析影像在显微镜中成像时所产生的绕射作用，试图设计出最理想的显微镜。

1879年，Flrmming(佛莱明)：发现了当动物细胞在进行有丝分裂时，其染色体的活动是清晰可见的。

1881年，Retziue(芮祖)：动物组织报告问世，此项发表在当世尚无人能凌驾逾越。然而在20年后，却有以Cajal(卡嘉尔)为首的一群组织学家发展出显微镜染色观察法，此举为日后的显微解剖学立下了基础。

1882年，Koch(寇克)：利用苯安染料将微生物组织进行染色，由此他发现了霍乱及结核杆菌。往后20年间，其它的细菌学家，像是Klebs 和 Pasteur(克莱柏和帕斯特)则是藉由显微镜下检视染色药品而证实许多疾病的病因。

1886年，Zeiss(蔡司)：打破一般可见光理论上的极限，他的发明--阿比式及其它一系列的镜头为显微学者另辟一新的解像天地。

1898年，Golgi(高尔基)：首位发现细菌中高尔基体的显微学家。他将细胞用硝酸银染色而成就了人类细胞研究上的一大步。

1924年，Lacassagne(兰卡辛)：与其实验工作伙伴共同发展出放射线照相法，这项发明便是利用放射性钋元素来探查生物标本。

1930年，Lebedeff(莱比戴卫)：设计并搭配第一架干涉显微镜。另外由Zernicke(卓尼柯)在1932年发明出相位差显微镜，两人将传统光学显微镜延伸发展出来的相位差观察使生物学家得以观察染色活细胞上的种种细节。

1941年，Coons(昆氏)：将抗体加上萤光染剂用以侦测细胞抗原。

1952年，Nomarski(诺马斯基)：发明干涉相位差光学系统。此项发明不仅享有专利权并以发明者本人命名之。

1981年，Allen and Inoue(艾伦及艾纽)：将光学显微原理上的影像增强对比，发展趋于完美境界。

1988年，Confocal(共轭焦)扫描显微镜在市场上被广为使用。

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