pcr技术的基本原理（PCR技术原理和步骤）

实验方法原理：实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，现在小编就来说说关于pcr技术的基本原理?下面内容希望能帮助到你，我们来一起看看吧!

pcr技术的基本原理

实验方法原理：

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实验步骤：

一、 样品RNA的抽提

1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

2. 两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

3. RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

4. RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。

5. RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

二、 RNA质量检测

1. 紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。

（1）浓度测定

A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：

RNA溶于40 μl DEPC水中，取5 μl，1:100稀释至495 μl的TE中，测得A260 = 0.21

RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

（2）纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定

（1）制胶

1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS电泳缓冲液

浓度 成分

0.4 M MOPS，pH 7.0

0.1 M 乙酸钠

0.01 M EDTA

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

（2）准备RNA样品

取3 μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

（3）电泳

上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。

（4）紫外透射光下观察并拍照

28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

三、样品cDNA合成

1. 反应体系

序号 反应物 剂量

1 逆转录buffer 2 μl

2 上游引物 0.2 μl

3 下游引物 0.2 μl

4 dNTP 0.1 μl

5 逆转录酶MMLV 0.5 μl

6 DEPC水 5 μl

7 RNA模版 2 μl

8 总体积 10 μl

轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。

2. 混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 μl，37℃水浴60分钟。

3. 取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR

1. β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3 μl按10倍稀释（加水27 μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。

2. 反应体系如下：

标准品反应体系

序号 反应物 剂量

1 SYBR Green 1 染料 10 μl

2 阳性模板上游引物F 0.5 μl

3 阳性模板下游引物R 0.5 μl

4 dNTP 0.5 μl

5 Taq酶 1 μl

6 阳性模板DNA 5 μl

7 ddH2O 32.5 μl

8 总体积 50 μl

轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。

3. 管家基因反应体系：

序号 反应物 剂量

1 SYBR Green 1 染料 10 μl

2 内参照上游引物F 0.5 μl

3 内参照下游引物R 0.5 μl

4 dNTP 0.5 μl

5 Taq酶 1 μl

6 待测样品cDNA 5 μl

7 ddH2O 32.5 μl

8 总体积 50 μl

轻弹管底将溶液混合， 6000 rpm短暂离心。

3. 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃　2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。

五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板

1. 针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

2. 反应体系

序号 反应物 剂量

1 10× PCR缓冲液 2.5 ul

2 MgCl2 溶液 1.5 ul

3 上游引物F 0.5 ul

4 下游引物R 0.5 ul

5 dNTP混合液 3 ul

6 Taq聚合酶 1 ul

7 cDNA 1 ul

8 加水至总体积为 25 ul

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72?C延伸5分钟。

（3）PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

（4）将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

六、 待测样品的待测基因实时定量PCR

1. 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。

2. 体系配置如下：

序号 反应物 剂量

1 SYBR Green 1 染料 10 ul

2 上游引物 1 ul

3 下游引物 1 ul

4 dNTP 1 ul

5 Taq聚合酶 2 ul

6 待测样品cDNA 5 ul

7 ddH2O 30 ul

8 总体积 50 ul

轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。

（3）将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。

七、 实时定量PCR使用引物列表

引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

八、电泳

各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

注意事项：

1.荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长长期设定一个荧光强度标准（即PCR扩增产物量标准）。荧光阈值可设定在指数扩增阶段任意位置上，但实际应用要结合扩增效率，线性回归系数等参数来综合考虑。

2.Ct值：在PCR扩增过程中，扩增产物（荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值具有极好的重复性。

其他：

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：

1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

北京泽平科技18年专业PCR技术供应服务，现部分仪器可免费申请试用，欢迎咨询！

产品列表：

编辑于 2020-10-26 · 著作权归作者所有

赞同 6

评论

收起

大家还在搜

pcr过程三次循环图解

pcr扩增的原理和步骤实验报告

pcr核酸扩增仪

琼脂糖凝胶电泳的原理

pcr扩增的原理和步骤视频

利用pcr扩增目的基因原理

pcr技术及应用实验

pcr扩增目的基因的原理

普通pcr扩增实验步骤

q pcr扩增的操作流程

qpcr实验步骤

q-pcr的操作流程

pcr技术的原理及操作步骤

pcr扩增过程画图

pcr引物设计详细步骤

简述pcr实验原理和步骤

pcr扩增的步骤

pcr扩增图解

pcr扩增引物数目计算

pcr步骤

答pcr实验步骤

pcr扩增的原理和步骤高中

pcr扩增实验报告

基因表达载体的构建

相关推荐

PCR技术基本原理_知乎

DNA的半保留复制DNA复制时,以亲代DNA的两条链分别作为模板,在DNA聚合酶的催化下,按碱基互补的原则合成两条... 该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活.PCR技术的原理在存在DNA模板、引物、dNTPs、适当缓冲液 (Mg2 ) 的反应混...

【分子】目的基因的扩增(一)——PCR原理与过程_知乎

文章来自GongZH:[植为一生]一、聚合酶链式反应的基本过程聚合酶链式反应(PCR)是通过PCR仪,模拟DNA半保留复制,从而体外快速扩增DNA的方式.生物实验室要用到PCR的地方……简直数不胜数.比如扩基因、检测、吃螺师粉儿(什么...

PCR原理三个基本步骤常见的PCR技术?_知乎

PCR又称聚合酶链式反应,PCR的过程可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加.PCR的三个步骤分别是1.高温变性:利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,;2.低温退火:低温(经常是60°C左...

点盏灯照亮新冠病毒——PCR检测法为何一抓一个准_知乎

估计现在大家每天都要关心世界新冠肺炎新增确诊数,每天的数字看起来都惊心动魄,我也一样为之担心,不过身边有一些朋友会问我一个问题,新冠病毒检测试剂盒到底是怎样起作用的?说实话这个过程其实有些复杂,目前首选的检测方法PCR荧...

目前来说NGS肿瘤检测相较于PCR方法对临床的指导意义有多大?_知乎

以NGS检测指导肿瘤诊疗,意义远超过PCR,有水平的医生都会选择,没水平的医生就瞎搞了.

相关搜索

pcr引物设计详细步骤

简述pcr实验原理和步骤

pcr扩增的步骤

pcr扩增图解

pcr扩增引物数目计算

pcr步骤

答pcr实验步骤

pcr扩增的原理和步骤高中

,