科研计划需要写参考文献么（思路找不到实验做不好）

不同方向的文章包含不同的实验技术，但是核心思路都是相似的。大多数科研工作者是通过阅读文献获得思路，但是如果没有自己的研究基础或者研究积累，也不了解每个实验的具体原理也没有丰富的实验经历，可能花费大量时间精力还吃亏不讨好。那么，如何开展一个课题呢？下面小编就以一篇文献为例，讲述一下这篇文献中的思路和部分实验技能，希望大家能举一反三，从中学得一些“套路”。

以2015年的一篇发表在Plant Cell 题目为Systemic Immunity Requires SnRK2.8-Mediated Nuclear Import of NPR1 in Arabidopsis 的文献为例，首先小编让大家快速了解一下课题设计和主线：

图1：课题主线

不论研究对象是植物还是动物，核心思路都是这样的。查阅文献寻找背景和线索-发现表型-机制解析，基于这三点我们再根据具体课题设计各种验证实验，下面就这篇文献进行分析。

一 背景和线索

图2 ：文献背景

已有研究表明植物体被外界病原菌入侵时，入侵部位发生快速而剧烈的细胞死亡的同时会杀死病原菌,远离被病原菌感染部位的部分会通过SA激活NPR1从而诱导SAR（系统获得性抗性）。但作者发现在感染病原菌时远端的SA含量只有少量增加，说明SA调节的SAR还需要额外的因子。此外，有文献报道SnRK2.8可以磷酸化NLT6等转录因子，而NLT6参与冷诱导的抗病过程，因此推测SnRK2家族成员可能参与SAR。

二 表型发现

SnRK2家族成员是否参与SAR呢？首先作者通过体外实验发现SnRK2.8的表达量确实受外来病原菌调控；其次SnRK2.8基因超量植株相比野生型更耐细菌侵染，且对snrk2.8突变体和野生型注射病原菌，野生型中快速有效地产生SAR而突变体中不能引起SAR，说明SnRK2.8确实参与SAR过程。

图3：体外体内实验探索SnRK2.8和SAR的关系

三 机制探究

SnRK2.8蛋白在SAR中发挥什么功能呢？查阅大量文献发现SA对SAR的诱导是必须的，因此需要首先判断SnRK2.8在SAR中发挥功能是否和SA有关。到底是SnRK2.8影响SA的含量还是SA能诱导SnRK2.8的表达，或者是SnRK2.8参与SAR依赖于SA。作者利用一系列实验发现SnRK2.8不影响SA的积累并且SA不能诱导SnRK2.8的表达但是SnRK2.8调控SAR是依赖于SA的。其次，SnRK2.8作为蛋白激酶如何调控SAR？SnRK2.8是否参与已报道的调控SAR的信号网络呢？SnRK2.8蛋白调控的上下游是什么呢？作者通过酵母双杂、BIFC及CO-IP等发现SnRK2.8确实和已报道参与SAR过程的NPR1蛋白互作。由于SnRK2.8蛋白是激酶并且有文章报道NPR1参与SAR必须以二聚体形式进入核中才能发挥共能，最后作者确定SnRK2.8能磷酸化NPR1从而促进NPR1的入核。

图4：SnRK2.8和SA的关系分析

图5：各种体内实验验证SnRK2.8和NPR1互作

图6：体外体内实验证明SnRK2.8在SAR中调控NPR1入核过程

上述基本就是这个课题的全过程，但是文章的完成不能只有思路，还需要扎实的实验技能，思路和实验技能是相辅相成的，缺一不可。下面给大家简单介绍一下这篇文献中涉及到的部分实验技能，希望对大家有所帮助。

四 实验要点

1. 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。一般我们可以通过qRT-PCR比较不同样品之间特定基因的表达量变化，此实验在这篇文献中用得相当多，算是基本操作，其中有很多需要注意的地方，下面我为大家介绍一下。

（1）RNA是否降解

Nanodrop 2000 只能检测RNA的浓度及纯度，对于RNA的完整性是没法检测的，一般实验室可以通过凝胶电泳检测，所有试剂和接触到RNA的仪器用DEPC冲洗，尽量保证胶的一致性，在nuclease-free情况下进行电泳，电压不要太高，否则因为温度高RNA会降解。

（2）cDNA 浓度是否一致

按道理说每个样品用相同含量的RNA进行反转录得到的cDNA应该一致，但是我们检测的RNA每个样品可能含有蛋白杂质，所以取的RNA模板可能不一致，先用看家基因检测一下稀释到80ng/ul左右的样品再来判断cDNA浓度是否一致。

（3）引物是否合适

做半定量PCR引物很重要，曾经看过一篇文章，作者对3kb的片段共设计了8对不同位置同样长度的引物，PCR检测表达量发现绝对量都不一样，并且引物的Tm值以及长度都影响着扩增效果。因此引物是否合适很重要，并且扩增片段长度不能太长，一般70bp到300bp都是可以的。

（4）加样一致性

做q-PCR很重要一点就是加样一致，因此我们均是配置MIX后再来分装，分装时用分装枪，因为手动加样可能会不均匀。一般使用RNA的EP管和枪头，因为RNA的枪头对于液体的粘着性比较低，可以尽量减少样品滞留在枪头上。一般每个样至少保证3个重复。

（5）PCR板保证干净

不要徒手抚摸PCR板的上方和下方，因此也不要在PCR上画标记，会影响荧光信号的采集。贴膜时一定要贴牢固了，不然可能做完RCR你的样品也蒸干了，我们实验室的新手经常犯这样的错误。

（6）冰上操作

一般做一整板PCR可能耗时太长，有的人甚至能用一两个小时，但是SYBR mix中有酶因此需要冰上操作。

2.酵母双杂交

酵母双杂交系统是在酵母体内通过重建有活性转录因子的结构来鉴定蛋白质之间的相互作用。转录因子可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录因子上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(Binding Domain, BD)和转录激活结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录激活都是必须的。在GAL4系统中利用转录因子GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD与激活结构域GAL4-AD的特异载体，分别与基因的ORFs融合，转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，从而与上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。

在本文献中作者通过此方法证明SnRK2.8和NPR1、TGA3互作，此实验中有以下几点需要注意：

（1）验证目的蛋白自激活活性

进行筛选之前必须验证目的蛋白是否有自激活，如无自激活活性可用于酵母双杂交筛库，如有自激活必须把自激活区域去掉才能用于酵母双杂交文库筛选。有些蛋白自激活特别强，可能需要截成特别短的片段才能进行筛选，这些都需要验证。

（2）确定3-AT浓度

跟其他验证蛋白互作实验一样，酵母双杂也需要阴性对照，必须验证目的基因连接BD的菌株和包含AD空载的菌株之间不会有互作，但是一般在没有抑制剂存在时上述情况是能发生的，那么在三缺培养基上仍然能长，因此出现假阳性。所以一般用含梯度的3-AT平板先做预试验，确定在什么浓度下的3-AT能抑制目的基因和含AD的空载的互作。

（3）x-gal显色时阳性对照很重要

在酵母双杂最后，能在三缺上长出来的酵母需要进行进一步验证，就是x-gal显色。显色时必须添加阳性对照，证明显色实验没有问题，否则本来是阳性菌却被认为是假的。

（4）实验操作中的小细节

a 转化酵母时，鲑精DNA变性很重要，这是介导质粒进入酵母的辅助物；

b 在热激酵母之前，转化Mixture中每加一种组份都要吸打均匀，以免出现沉淀；在转化效率不能满足实验需要时，可增加体系中Salmon Sperm DNA的浓度。

c 确定3-AT浓度时，最好确定两次以上，因为3-AT浓度决定着你的结果是否正确。

d mating时，不要用过小的三角瓶，以免降低转化效率；摇动速度不可过高以免降低 mating 效率，也不可过低防止酵母细胞沉淀。

e 检测菌液OD600时，应稀释2倍及5倍后测定，再计算原液的浓度。

3 Pull Down 和CO-IP

简单讲Pull Down 和CO-IP都是为了验证两个蛋白是否互作的方法，只是一个是验证体外蛋白互作，一个是验证体内的。但是原理都是一样，都是通过标记的标签蛋白（体外一般是GST,HIS,MYB等，体内一般有HA,GFP,FLAG,Strep等标签）从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白，确认两个蛋白之间是否互作。一般是用Western blot检测。在整个过程中有哪些需要注意的呢，小编也为大家整理了一些。

（1）浓度低和纯度低的蛋白也能上样

很多人可能认为做Pull Down 和CO-IP实验的蛋白样必须高浓度和高纯度，其实不然，对于此实验我们最终是利用用Western blot来检测灵敏度相当高，此外当蛋白浓度不够时我们只需要加大蛋白量就可完成此实验；至于有杂带也没有什么影响，只要用Western blot检测时能检测到真正的目的带即可。

（2） 阴性对照很重要

很多人做Pull Down 和CO-IP会将实验组和对照组分开做，这样其实是不严谨的。我们必须保证整个实验流程一致才能证明目的蛋白之间存在互作，因为这个实验弹性很大，如果孵育时间太长，而wash时间又太短，空GST也能和目的蛋白互作，这种情况我们实验室有很多，所有不能先做实验组证明有互作了，就随便加一组对照。

（3） 孵育时间看自己

这个意思就是做Pull Down 和CO-IP的时间可以自己定，这个过程不同蛋白之间是不一样的，有的蛋白互作可能特别强，因此可以直接孵育1h就可以，有的蛋白可能互作比较弱，可能需要孵育4h或者过夜。因此这些都取决于你的蛋白之间的结合力。

（4） 预试验不可缺

什么叫预试验呢，就是对于新手来说你在做Pull Down 和CO-IP时每一步的流出液或者洗脱液都应该收集起来进行检测，这样是为了更好分析你的实验是在哪一步出错，否则实验失败以后也不明白为什么，只能无意义的重复，浪费时间和精力。例如我见过我们实验室一员她在input中检测到蛋白，在wash buffer和流出液中及elution中都没有检测到蛋白，因此她认为没有互作，其实我们应该分析蛋白去哪了，既然input有，但是哪里都没有蛋白说明目的蛋白在beads没有被elution下来，有可能互作蛋白都在beads上而你没有检测到。

（5） 蛋白提取液非常重要

不用类型的蛋白提取液不同，对于一般核或者质蛋白可能SDS溶液即可，但是对于一些膜蛋白就有特殊的提取方法。如果这一步不区分开可能完全没有办法进行后续实验。

4 烟草体系BIFC

在荧光蛋白（YFP、GFP、Luciferase 等）的两个β片层之间的环结构上有许多特异性位点可以插入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。BiFC 技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基团而发出荧光，此实验都用于在烟草植株活体细胞中检测蛋白质-蛋白质相互作用。此实验有这几点需要注意：

（1） 农杆菌的选择

GV3101、EHA105、LBA4404 这三种农杆菌均有报道可以用于烟草瞬时转化。在培养农杆菌时候除了添加载体所含有的抗生素外，不同农杆菌还需要添加其它种类抗生素，比如 GV3101 还需要添加 50μg/ml 的利福平。

（2） 烟草状态很重要

选择健康、处于壮年的烟草叶片进行注射，太小的可能注射不进去，太老的表达效率较低。叶片气孔打开的时候比较容易注射，因此最好在白天注射。

（3） 适当的农杆菌菌液浓度

农杆菌菌液浓度是需要自己摸索的一个参数，OD600 = 0.6并不一定适用于所有的基因，高浓度可能导致叶片死亡，或者影响定位结果，建议设置不同浓度梯度进行比较，在可以获得荧光信号的前提下尽量采用低浓度的菌液。

（4） 农杆菌活性相当重要

在YEB中培养农杆菌时，OD一般达到0.8-1时菌的活性最佳，在0D超过1后甚至1.5后，可能因为活性不够而导致荧光很弱，最终判断错误。因此，尽量保证农杆菌活性。

（5）预试验判断转化效率

不同外源基因的瞬时表达效率大不相同——这一点在单转做亚细胞定位的时候表现得特别明显，效率高者基本每次都能达到100%发光，低者可能转10次只能表达出一两次，建议在BIFC之前先做个亚细胞定位评价一下两个基因的表达效率，以便调整两个质粒的转化条件。

（6） 观察时间

注射后的植株通常在2d之后观察，但不同基因表达的时间可能在1-7天不等，需要第一次实验时每天都观察一下，判断什么时候表达量最强。

5 蛋白质磷酸化活性分析

蛋白质磷酸化指的是由蛋白质激酶催化的把三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）或三磷酸鸟苷（Guanosine triphosphate, GTP）γ位的磷酸基团转移到底物蛋白质氨基酸残基（如丝氨酸、苏氨酸等）上的过程。本文献中以放射性同位素标记的[γ-32P]ATP作为磷酸基团的供体，SnRK2.8与待NPR1共同反应30min，之后通过 SDS-PAGE 凝胶电泳分离，用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质，从而判断待测蛋白质是否具有磷酸化活性或自磷酸化活性。这里小编也总结了几点注意要点，提供大家参考。

（1）磷酸化反应过程

对于某些对特殊离子具有依赖性的蛋白激酶（如钙离子依赖性蛋白激酶），应对 kinase buffer 中的成分进行调整；此外不同类型的蛋白激酶buffer也有所不同，若是从未做过磷酸化的蛋白，需要自己尝试不同的反应体系；至于反应温度和反应时间，一般是室温反应30min，但是对于某些对温度敏感的蛋白激酶，应调整反应温度，时间也可以自己延长到6h。

（2）操作谨慎

放射性同位素操作应在规范的专用操作室内进行；含放射性同位素的废弃物（废纸、废液等）应按规定进行规范处理。

（3）蛋白活性

尽量避免待测蛋白在制备过程中活性受到损害，如果蛋白质活性不够，实验结果将完全不可信。

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