扩增仪器通道分类（扩增试剂适配性问题大揭秘）

在qPCR扩增实验室中，相信大家也经常遇到这种情况：我们使用试剂A同时扩增体系1和体系2，体系1得到的扩增结果明显优于体系2；但是，如果换用同类型试剂B对体系1和体系2进行扩增，体系2得到的扩增结果反而更好。

这是巧合还是有规律可循？扩增试剂难道对不同体系有不同的适配性？不乱猜了，让我们拿实验数据说话！这里，小编以不同GC含量模板为变量，使用探针法荧光定量PCR的方法进行一探究竟！

说到这里，有人该问了，GC含量不同是什么意思呢？不要着急，小编来解答：首先，GC含量是指在核酸序列中，鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的比率，又称为G C比值或GC比值，用公式可以表示为：[（G C的总数量）/（A T C G的总数量）] * 100%。小编本次实验就是围绕不同GC含量的DNA序列为扩增模板展开的。

图1. GC碱基对的配对性质（图片源自网络，侵删） 图1. GC碱基对的配对性质（图片源自网络，侵删）

一般地，扩增模板GC含量会控制在40%~60%，最佳为45%-55%。GC含量超出范围值，就会对特异性扩增造成阻碍。高GC片段一般指DNA中GC含量高于60%的片段；低GC片段则指DNA中GC含量低于40%的片段。

那么，针对GC含量不同的体系，我们使用3款探针法荧光定量专用预混液进行比对测试，每个体系测试3个复孔。以平均CT值为检测指标，判断检测试剂的扩增效率。比较平均CT值和荧光终点，CT越小，检测效率越高，若△CT值在±0.5以内，认为灵敏度无显著差异。结果如下：

※ 在两个普通GC含量（53.5%、50.6%）体系中实验结果如下：

图2. 普通体系扩增结果示意

结果说明：在两个普通体系下，3款试剂的扩增效率无显著差异（两两比较，△CT值均在±0.5以内），但是，从扩增曲线中可以很明显地看出，试剂A的荧光终点显著高于其他两款试剂，说明在普通体系中，试剂A相比于其他两款试剂有较高的适配性。

※ 在4个高GC（62.30%、67%、68.4%、63.1%）体系中实验结果如下：

图3. 高GC体系扩增结果示意

结果说明：在4个高GC体系中，三款试剂的扩增表现出较大差异：试剂B相较于其它两款扩增试剂CT值较小，且达到显著差异，而其它两款试剂CT值不存在显著差异；在扩增曲线中，试剂B也呈现出较高的终点荧光，因此，试剂B具有较好的高GC体系适配性。

※ 在4个低GC（34%、35.5%、38.8%、38.1%）体系中实验结果如下：

图4. 低GC体系扩增结果示意

结果说明：在4个低GC体系中，三款试剂的扩增表现出较大差异：相较于试剂B，从△CT值和扩增曲线荧光终点来看，试剂A和试剂C均表现出较好的扩增优势，且试剂A和试剂C之间无显著差异。

综合以上结果，不难看出，三种试剂对于不同GC含量体系的适配性是不同的。在普通体系中，试剂A检测效率优于其他两款试剂；在高GC体系中，试剂B整体检测效率更优；而在低GC体系中，试剂B整体检测效率不如试剂A和试剂C。因此，试剂B更适配于高GC体系，正如文章开头中提到的困扰大家的问题，很显然，这是不同试剂适配体系不一致导致的。

为什么会出现这种情况呢？

小编“翻箱倒柜”，才恍然大悟。首先，高GC作为扩增途中的大型“拦路虎”，具体到扩增的三个阶段，高GC含量PCR扩增的难点在于：

1.难变性：DNA模板在常规变性温度下，解链不完全；

2.难退火：由于DNA模板形成的二级结构，退火时引物不易与模板结合；

3.难延伸：由于DNA模板形成的二级结构，使PCR产物的延伸效率大幅下降[1]。

图5. 基于抗体法修饰酶的热启动PCR扩增三部曲（图片源自网络，侵删）

为了增加高GC靶片段的扩增特异性和产量，一般会有各种优化方式。除了适当提高变性温度、调整模板等关键反应要素的浓度之外，对于扩增试剂本身来讲，添加增效剂（如甜菜碱、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、甘油、吐温-20等）是消除复杂的二级结构、获得大量高GC体系特异性扩增产物的有效途径[2]。但是由于增效剂的浓度不好把控，应用在其他体系中，很有可能会造成较大的扩增抑制[3]，因此，就出现了不同扩增试剂适配不同体系的最终结果。

诺唯赞作为服务于动物疫病检测等领域专业的产品和解决方案供应商，立足于酶学技术创新，结合大量验证实验，开发出适配于不同GC含量体系的检测试剂，帮助大家减少体系开发周期，获得性能更优的检测试剂。

【参考资料】

[1] 张争, 张杨, 徐进, 等. 高GC含量青枯菌aac基因PCR扩增体系的建立与优化[J]. 植物保护, 2008(02): 90-93.

[2] 高梅, 刘树人, 李强, 等. 高GC含量DNA序列PCR扩增的引物设计[J]. 华南国防医学杂志, 2014, 028(007): 633-638.

[3] Zheng Z, Yang Z, Jin X, et al. Establishment and optimization of the PCR system for amplification of aac gene from GC-rich Ralstonia solanacearum[J]. Plant Protection, 2008.