mrna疫苗影响因素：mRNA疫苗中修饰核苷酸的重要作用

新型冠状肺炎爆发以来，学术界、制药业和大众都努力寻求有效的应对策略，从寻找药物到疫苗开发“竞速”，各国政府和机构组织、企业在持续不断加码；全球积极开展疫苗研发，mRNA疫苗技术平台促进了疫苗的快速开发，mRNA疫苗作为新一代的核酸疫苗也迅速吸引了大众的目光。

研究表明核酸疫苗在对抗几种类型的癌症和传染性病原体方面的有效性，而传统的疫苗平台可能无法诱导保护性免疫反应，核酸疫苗将减毒活疫苗的免疫学特征(如内源性抗原表达和T细胞诱导)与灭活疫苗或亚单位疫苗(如确定的组成和安全性)结合在一起[1]，在研发生产实效性上核酸疫苗也具有决对的优势。这些主要归功于安全有效的体内基因传递材料和高质量基因的生产方案的不断优化。

经过多年的研究，让制造高质量的“治疗性”可高度翻译且不引起严重炎症的核糖核酸这一主要限制在很大程度上通过一些关键的创新得到了解决，例如通过掺入了修饰的核苷[4，5](特别是修饰的尿苷)，优化了编码序列并通过高效液相色谱(HPLC)对IVT mRNA进行了严格纯化，去除dsRNA残留；所有这些技术都有助于抑制合成mRNA的免疫应答，从而降低毒性并改善基因的翻译[2]。

新型修饰核苷酸的合成及其掺入核酸序列为改变核苷酸的化学性质提供了许多可能性，这大大拓宽了核苷酸的实际应用领域。如，mRNA结构的“加帽”在包括翻译起始、剪接、细胞内转运等在内的多种细胞过程中起着至关重要的作用。人工合成“加帽类似物”对体外合成的mRNA进行修饰，可提高mRNA的翻译效率和转染效率，成为科学研究的重要手段[3]。当核酸疫苗/药物应用于人体，减少对人的毒副作用是首要的，在mRNA序列合成阶段，掺入修饰核苷酸以及在合成的mRNA 5’封端（加“帽”）、3’加Poly（A）均是有效的做法，此前，德国疫苗巨头CureVac的新冠mRNA疫苗因mRNA合成时没有使用修饰核苷而导致毒性较大引起了人们的广泛热议。

从化学角度来说，修饰核苷酸是含有一个或多个修饰基团的核苷酸类似物，这些基团可能包括硼酸、甲基、甲氧基、生物素等。核苷酸由3部分组成：碱基、五碳糖、磷酸基团。

核苷酸结构图

以上的修饰在这3个部分都可以进行，所以根据修饰位置的不同，可以分为：碱基修饰、糖基修饰以及磷酸基修饰。除了这些传统修饰的核苷酸，还有一些特殊修饰的核苷酸，比如：非核苷5’三磷酸酯、西多福韦二磷酸酯（Cidofovir-Diphosphate）它的五碳糖由闭环变成了开环结构，并且只含有2个酯键。

根据修饰核苷酸修饰位置不同，主要可以分为以下8类：

1、糖基修饰核苷酸

糖基改造修饰的类型包括无环核苷,脱氧核苷,杂原子引入,构型变化,糖环大小的变化等。主要用于链终止的2’端的修饰，或者表面/分子连接的氨基的修饰以及点击化学的2’叠氮基修饰等。

2、碱基修饰核苷酸

常在碱基的位置进行一个甲基化，用于提高Tm值、引入突变、干细胞研究、mRNA药物研发、适体设计（SELEX）。mRNA疫苗研发中常进行假尿嘧啶化修饰，尿嘧啶修饰是最丰富的 RNA 修饰，一般由尿苷的异构化产生，已有的研究表明，mRNA 的假尿嘧啶化修饰主要有三个功能：改变密码子、增强转录本稳定性和应激反应应答。

3、磷酸基修饰核苷酸

常见的修饰方法是硫代，硫结合到磷酸基上，或者硼酸基取代磷酸基团，磷酸基修饰核苷酸常通过体外转录/PCR掺入目的片段，以获得抗核酸外切酶的抗性。

4、非核苷5’三磷酸酯

一般用于抗病毒研究，如上文提到的西多福韦二磷酸酯，开环结构，能够竞争性的抑制病毒中的DNA，破坏DNA的延伸，终止DNA合成。

5、双磷酸酯核苷（5’及3’均含有磷酸基团）

应用场景主要在应激反应，比如饥饿条件下，核苷二磷酸和RNA聚合酶会减少翻译的合成，并且增加生物合成基因的转录，保证保持细胞内氨基酸和脂肪保持在正常水平。

6、标记的单/三磷酸酯

这种修饰在磷酸基团上加了生物素，常用于蛋白互作研究，是核酸和蛋白功能研究中常见的标记物。整体应用场景较多，能在SELEX开发适体中进行目的片段或者靶蛋白的富集，同时，如果上面标有生物素则可用于核酸捕获/纯化，以及示踪剂标记、免疫测定、核酸检测等方面。

7、加帽类似物

mRNA体外合成的修饰，在核苷酸的5’磷酸基团上用鸟苷形成5’三磷酸酯骨架的结构，在最近火热的mRNA疫苗/药物开发中应用广泛，5'帽子可以促使 mRNA 和核糖体的结合，能有效地封闭 RNA 5'末端以保护 mRNA 免疫 5'核酸外切酶的降解，增强 mRNA 的稳定性。此外，5'帽子还参加 mRNA 前体的剪接，参与 mRNA 3'末端多聚腺苷酸化，保证mRNA在细胞质中的稳定运输。

8、5’-3’二核苷酸

是一种存在于生物体内，2个核苷通过5’、3’的磷酸脂键连接在一起组成的物质，哺乳动物中的RNA聚合酶可以利用二核苷酸从而引发启动子的特异性，促进转录，启动DNA复制。

修饰核苷酸已被广泛应用于医药领域(包括此次新冠mRNA疫苗/药物的合成），目前对假尿嘧啶化修饰和 2'-O - 核糖甲基化修饰位点的定位可以达到单核苷酸的精度。

作为国内一家生命科学领域专业的研发生产公司，诺唯赞能够提供从模板的合成、转录、加帽、加尾到纯化的全套解决方案，助力mRNA疫苗研发与生产。

订购信息

[1] Thomas S., et al.,Developing mRNA-vaccine technologies, RNA Biology, 2014. 9:11, 1319-1330.

[2] Norbert P., et al., Recent advances in mRNA vaccine technology, Current Opinion in Immunology, 2020 Aug;65:14-20.

[3] APExBIO

[4] John Karijolich., et al., Converting nonsense codons into sense codons by targeted pseudouridylation, Nature 2011 Jun 15;474(7351):395-8.

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