合成生物学top1期刊（Nature.定向几丁质生物合成的结构基础）

大家好，今天推送的文章来自Nature上的“

Structural basis for directional chitin biosynthesis

”通讯作者为中国农业科学院植物保护研究所/农业基因组研究所的杨青教授。

几丁质是自然界中最丰富的氨基多糖，是一种由N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）单元组成的胞外聚合物。几丁质生物合成的关键反应是由几丁质合成酶催化的，这是一种膜整合的糖基转移酶，可以将GlcNAc从UDP-GlcNAc转移到一个生长中的几丁质链上。然而，这一过程的确切机制尚未阐明。该报道了一种来自破坏性大豆根腐病致病性卵菌大豆疫霉（PsChs1）的几丁质合酶的低温电子显微镜结构。它们代表了apo、Glcnac结合、新生的几壳质寡聚物结合、UDP结合（合成后）和几丁质合酶抑制剂尼克霉素（NikZ）结合的状态，为几壳质生物合成及其竞争抑制的多个步骤提供了详细的观点。这些结构揭示了几丁质合成反应室具有底物结合位点，聚合物催化中心和聚合物转移通道的入口，允许产物聚合物被排出。这种排列重现了几丁质生物合成中连续的关键事件，从UDP-GlcNAc结合和聚合物延伸到产物的释放。作者在几丁质易位通道中发现了一个摆动环，它作为一个“门锁”，阻止底物离开，同时引导产物聚合物进入易位通道，放电到细胞膜的细胞外侧。该研究揭示了几丁质生物合成的定向多步骤机制，并为抑制几丁质合成提供了结构基础。

酶活性

PsChs1主要在溶液中以二聚体的形式纯化（扩展数据图2a-c）。PsChs1的活性明显依赖于特定的二价离子，而EDTA完全阻断了酶的活性（扩展数据图2d）。GlcNAc和二价离子的加入显著提高了PsChs1的活性（扩展数据图2d）。酶动力学显示Hill系数为1，表明GlcNAc不是PsChs1的正效应物（扩展数据图2e）。与之前的数据一致，酵母几丁质合酶Chs2可以利用GlcNAc的2-酰基酰胺类似物作为UDP-GlcNA17衍生的GlcNAc的受体，这一发现表明游离的GlcNAc可能作为启动反应的受体。值得注意的是，添加（GlcNAc）2-5并不影响酶的活性（扩展数据图2f）。

PsChs1产生的糖聚合物可以被专门水解几丁质的几丁质酶营养蛋白Chi-h降解，证实该产物为几丁质（扩展数据图2d）。 利用扫描电子显微镜，作者观察到合成的甲壳素呈纤维材料，甲壳素纤维的数量随着反应时间的增加而增加（扩展数据图2g）。 在共聚焦激光扫描显微镜下，用小麦胚芽凝集素与荧光团荧光素偶联，特异性检测几丁质。在扫描电子显微镜高倍镜下为聚集的纤维材料，在共聚焦激光扫描显微镜低倍镜下为“圆形”软材料（扩展数据图2h）。通过x射线衍射和衰减全反射傅里叶变换红外（ATR-FTIR）光谱确定合成的同构类型（扩展数据图2i)。如ATR-FTIR光谱，合成几丁质显示相同的吸附光谱虾α-几丁质，其中，在1620-1670cm−1处出现的特征C=O拉伸（酰胺I）带呈双态，与晶体β-几丁质中出现的单线态明显区别。ATR-FTIR光谱与x射线衍射结果一致。合成的几丁质在9.3°、12.7°、19.3°和26.4°处的4个尖锐衍射峰，分别对应于020、021、110和013平面，是α-几丁质的典型晶体图案。因此，PsChs1合成的聚合物为α-几丁质，这与文献中证明在卵菌种中形成的几丁质属于α-型的数据一致。

PsChs1的架构

通过C2对称重建PsChs1的不同低温电子显微镜结构，总体分辨率为3.1Å（UDP结合）、3.2Å（NikZ结合）、3.3Å（apo和UDP-GlcNAc结合）和3.9 Å（UDP/（GlcNAc）3结合）(扩展数据表1和扩展数据图。3–7)。EM图具有足够说明，允许在所有五种结构中重新构建残基40-860，其中残基743-758的无序区域。供体底物结合的结构显示了来自残基23-39的一个额外的N端区域（扩展数据图4e）。所有结构均包括N端结构域（NTD）、糖基转移酶（GT）结构域和C端跨膜（TM）结构域的所有α螺旋（图1a-c）。TM区域由6个TM螺旋（TM1-6)组成，位于膜和细胞质边界的三个两亲界面螺旋（IF1-3）的顶部上（图1c和扩展数据图8a）。虽然TM拓扑算法预测IF3会形成一个TM螺旋（扩展数据图8b），但作者给的结构显示，它实际上是形成了一个平行于膜的弯曲螺旋，正如之前对酵母中的Chs3所提出的那样。TM5是一个非常长的螺旋（长度大约80Å），从TM结构域延伸到胞质区域，并像一把剑一样投射到相反的原聚体中（图1b）。

NTD包括三个子结构域：一个微管相互作用和传输（MIT）子结构域、一个连接（LG）子结构域和一个交换（SP）子结构域（图1c)。MIT亚结构域存在于许多真核生物的许多类型的蛋白质中。然而，在CHS家族中，MIT亚结构域仅在一些卵菌中被鉴定出来。PsChs1 MIT子结构域由三个螺旋组成，形成一个反平行的螺旋束（扩展数据图8c）。PsChs1 MIT结构与其他几个已知的MIT域覆盖，包括来自人类、小鼠、卵菌腐腐菌和真菌的域，显示了整体拓扑的显著相似性（扩展数据图8e）。两个保守的非共价螺旋间相互作用稳定了MIT亚结构域的结构，包括连接螺旋α1和α2的丙氨酸拉链（扩展数据图8d）和连接螺旋α2和α3的典型螺旋螺旋。卵菌MIT亚结构域先前被认为参与了CHS的运输和靶向菌丝顶端或内吞循环。

包含催化机制的PsChs1 GT结构域采用了经典的GT-A折叠，由一个被7个α螺旋包围的8链β片组成，通过IF1到IF3与TM区域相连（图1c）。IF1倾向于TM4和TM6。IF2包含Q（Q/R）XRW基序，该基序在纤维素和透明质酸合成酶中也很保守。IF3位于IF1和IF2的顶部，通过TM4与TM1广泛相互作用，使其稳定在细胞质-脂质界面上（扩展数据图8a）。

反应室

GT域的反应室包括一个用于底物结合的桶和一个用于合成反应的洞穴（图1d，e）。该桶由先前报道的三个基序TMYNE（残基237-241）、DGR（残基291-293）和DVGT（残基382-385），以及一个新发现的KASKL基序（残基355-359）组成（图1e和扩展数据图1b）。KASKL基序形成了桶的一堵壁，将桶与催化中心分开。具体来说，Asp291和Asp382的突变，‘D，D，D，Q（Q/R）XRW’基序的前两个天冬氨酸，在加工的β-糖基转移酶中保守，完全消除了酶活性（扩展数据图2j）。

桶旁边的洞穴两侧是Glu495和保守的EDR基序的催化残基Asp496（残基495-497），另一侧是KASKL基序的Leu359（图1e）。CHS催化的反应可能通过双分子亲核取代反应置换机制发生，脱质子的Asp496作为一般碱，促进对异聚碳的亲核攻击。与这一假设相一致的是，将Asp496突变为丙氨酸可以消除催化活性，而将其突变为天冬酰胺可以强烈降低催化活性。此外，将Glu495或Leu359突变为丙氨酸分别导致约95%和约70%的活性损失，表明这些残基在催化作用中的重要性（扩展数据图2j）。

保守的SWG基序（残基741-743）位于连接IF3和TM5的柔性细胞质环上。然而，这个回路的EM图很弱。这个基序可能与底物入口有关，因为它位于反应室附近。Trp742突变为丙氨酸消除了酶活性，这一事实支持了这种可能性（扩展数据图2j）。

几丁质易位通道

推测的几丁质易位通道位于TM区域，并连接着细胞膜的胞外侧和胞内反应室。该通道的宽度约为8-12Å，长度约为40Å（图1d和扩展数据图9c）。由于GlcNAc的宽度约为8Å，长度约为5.5Å（扩展数据图9b），该通道应该能够容纳包含至少7个GlcNAc单元的几丁质链。该通道的入口由VLPGA(残基452-456）、QHFEY（残基429-433）和QRKRW（残基535-539）基序组成（图1e）。QHFEY和QRKRW基序分别属于IF1和IF2，位于通道两侧，通过Glu432和Arg536之间形成的盐桥以及Tyr433和Trp539之间的疏水相互作用。相比之下，VLPGA 基序位于一个灵活的环上，作者已经证明它可以作为门锁来控制对几丁质转运通道的访问。这些基序中的Glu432、Tyr433、Val452、Pro454、Arg536和Trp539突变为丙氨酸，极大地削弱了酶活性（扩展数据图2j）。

二聚体PsChs1

在侧视图中，PsChs1二聚体类似于一个六边形的雪花（图1a，b）。这两个PsChs1前聚体通过围绕垂直于膜的轴旋转两次而相互关联。PsChs1二聚体掩埋了一个较大的相互作用界面，该界面被NTD和TM区域所稳定（图2a）。

在TM区域，一个前聚体（PsChs1α）的TM2与另一个前聚体（PsChs1β）的TM5形成了大量的疏水相互作用，PsChs1α的TM2和TM3之间的环也与PsChs1β的TM5相互作用（图2b）。PsChs1β TM5的胞质部分依次与PsChs1α的SP、MIT和GT结构域相互作用（图2c）。两个PsChs1前聚体中的两个NTDs相互包裹，形成一个对称的域交换界面（图2a）。SP亚结构域的螺旋α1是一个两亲螺旋，其疏水侧面对相反的前聚物的MIT亚结构域，从而与MIT亚结构域的螺旋α2和α3形成疏水相互作用（图2d）。PsChs1α SP子结构域的β1片与PsChs1β LG子结构域的β1片平行，形成氢键、H-π和阳离子-π堆叠作用（图2e）。SP亚结构域（ΔSP）的截断破坏了PsChs1二聚体的形成，导致蛋白质聚集，但对酶活性的影响不大（扩展数据图2l）。

二聚体PsChs1的结构复杂与供体底物或新生的甲壳素低聚物表明每个原聚物功能独立但平行，也就是说，两个甲壳素链同时产生CHS同型的两个亚基二聚体，这样这些链组装减少结束指向同一方向。酶活性与供体底物浓度的曲线图与米氏方程相吻合良好，该方程给出的Hill系数为1，支持了两个PsChs1前聚物之间没有合作效应（扩展数据图2e）。

UDP-Glcnac-绑定 Pschs1

为了获得供体底物UDP-Glcnac结合结构，作者将催化作用重要的残基Glu495突变为丙氨酸，使酶能够将底物捕获在其底物结合位点（图3a，扩展数据表1和扩展数据图4）。Glu495的作用是很有趣的。在apo结构中，其构象不同于UDP结合态和UDP/（GlcNAc）3结合态的构象，其羧基指向底物结合位点，有助于供体底物在底物结合位点的识别和正确定位（图3b，e）。之前发表的一些底物结合的GT-A糖基转移酶结构显示，这种谷氨酸与供体底物的糖部分有很强的相互作用（扩展数据图8h），这支持了该残基对于供体糖的识别和结合到底物结合位点很重要。UDP-GlcNAc 的尿苷部分固定在反应室的桶内，它由酶 GT 结构域中从 Thr237 到 Glu241 的环区组成，通过与该区域中的残基的一系列相互作用（图 3a ）。GlcNAc部分似乎暴露在溶剂中，并朝向远离催化位点。UDP-Glcnac结合的PsChs1与apo-PsChs1的叠加没有显著的局部或全局结构差异（693个Cα原子的均方根偏差为0.54Å）。在N端序列（残基23-39）结构中未得到解决，在UDP-GlcNAc复合物中以α-螺旋的形式出现（扩展数据图4e）。这个螺旋延伸到相反的原聚物中，并通过氢键与LG子结构域相互作用（扩展数据图8g）。apo和UDP-Glcnac结合态的结构比较显示，Pro38、Leu39和Pro40残基位于不同的位置，表明UDP-Glcnac结合态的SP子结构域的N端延伸采用了不同的构象（扩展数据图8f）。

UDP/（Glcnac）3-绑定Pschs1

得到了每个PsChs1原聚体中与预易位（GlcNAc）3和UDP结合的二聚体PsChs1的结构（图3c，扩展数据表1和扩展数据图5）。这反映了甲丁质生物合成过程中的糖基后转移状态。（GlcNAc）3通过一系列相互作用，包括氢键和疏水相互作用，被困在疏水通道中（图3c）。第二个GlcNAc部分位于通道的入口，夹在Pro454和Trp539之间。新添加的GlcNAc部分延伸到通道外，代表了一个易位前的状态。与底物结合的PsChs1一样，UDP的尿苷部分固定在尿苷结合桶中。然而，与apo结构不同的是，在UDP/（GlcNAc）3结合结构中观察到VLPGA环约7Å的缩回（452-458）和Pro454侧链约100°的翻转（图3b，左图）。因此，几丁质转运通道的入口被打开。在这种状态下，功能重要的残留Glu495的侧链定向远离底物，类似于UDP绑定或UDP/（GlcNAc）3绑定状态（图3b，右面板），代表一个构象的糖部分从供体底物转移到受体刚刚完成。QRKRW基序的Arg538位于反应室的入口，其侧链具有高度的灵活性，在载脂蛋白和底物结合态下采用不同的转子体（图3b，右图）。在所有底物结合、产物结合和UDP结合的结构中，它与UDP-GlcNAc或UDP的二磷酸基团形成电荷相互作用。这表明Arg538作为引导剂，引导供体底物进入反应室，并确保底物合成的正确位置。

PsChs1含有与GT2酶（特别是纤维素合成酶）相似的保守活性位点残基，如来自球形红杆菌的RsBcsA单体和来自树白杨×的PttCesA8同源三聚体。然而，与RsBcsA相比，PsChs1具有更大的催化室和更宽的易位通道，周围的残基更小，这使得PsChs1能够容纳GlcNAc中体积庞大的N-乙酰基（扩展数据图9b，c）。

PsChs1残基Thr385和Leu412位于底物结合桶的侧面，位于几丁质易位通道入口的正下方，在RsBcsA中被庞大的组氨酸残基所取代。另一个小的残基，Ser357，属于PsChs1中与底物结合桶接壤的KASKL基序，在RsBcsA中被His224所取代（扩展数据图9a，e）。如果将PsChs1中的这些残基突变为组氨酸，则会降低了该酶的活性（扩展数据图2j）。结构比较表明，PsChs1有一个α-螺旋（残留496-504）和一个部分无序环（残留736-759），其位置类似于RsBcsA的“手指螺旋”和“门环”（扩展数据图9a），在RsBcsA新生纤维素易位过程中发生巨大的构象变化。然而，作者的结构表明，无论是与供体底物结合，还是与新生的甲壳素链结合，都不会导致PsChs1指螺旋的显著构象变化。PsChs1中相应的门控环仅被部分分解，这使得很难识别任何构象变化。这两种结构元素在CHSs中是否具有可比性的功能还有待进一步研究。

Mn2 偏好几丁质的合成

UDP/（GlcNAc）3结构，Mn2 离子形成坐标键的离去基磷酸基键长为2.2-2.3Å（图3c），这是一致的范围坐标键第一个过渡金属和含氮或含氧化合物。UDP-Glcnac结合结构中的Mn2 离子只与磷酸基形成电荷相互作用，键距大于3.5Å，比坐标键弱得多。这可能代表了不同甲壳素生物合成状态（后催化和预催化）中的不同二价离子结合模式，并证实了金属离子在协助糖基从供体基质转移到chs和其他糖基转移酶的受体中发挥着重要作用。

Mn2 离子是一种具有空三维电子轨道的过渡金属和与磷酸基配位成键的强刘易斯酸。然而，Mg2 离子是一种碱土金属，它没有空的d轨道，和一个较弱的刘易斯酸。因此，Mg2 离子只能与弱于坐标键的磷酸基形成电荷相互作用。因此，Mg2 离子协助催化的几丁质生物合成的能力不如Mn2 离子强（扩展数据图2d）。

一个摆动的环指导几丁质的合成

与UDP结合的二聚体PsChs1结构代表了其新生的几丁质释放状态（图3d，扩展数据表1和扩展数据图6）。与预易位（GlcNAc）3和UDP复合物中的PsChs1相比，UDP结合结构中的β-磷酸基向反应室中心翻转约55°，代表酶的合成后状态（图3c-e）。UDP结合结构中的VLPGA环（残基452-456）将7Å移动回apo和UDP-GlcNAc结合态的位置，这与UDP/（GlcNAc）3结合态不同（图3b，e）。这个环，特别是Pro454，不仅作为通往通道的通道，还稳定新生的甲壳素低聚物的第二糖。将Pro454突变为丙氨酸可消除酶活性（扩展数据图2j)。VLPGA环在酶的不同状态下的位置表明，这个环作为一个“门锁”，它阻止供体底物在与生长中的几丁质低聚物连接之前离开。此外，它引导产品聚合物的头部通过通道的出口朝向细胞膜的胞外侧。

PsChs1的载脂蛋白结构是第一个膜整合加工糖基转移酶的例子，具有明显连续但空的跨膜通道，在几丁质合成启动之前提供了一个真正的关闭状态。对PsChs1的apo和UDP/（GlcNAc）3结合态的分子动力学模拟表明，VLPGA基序也作为一个渗透性屏障，在apo状态下阻止水通量通过膜（扩展数据图9f，g和补充视频1和2）。

这种摆动环在CHSs中似乎高度保守，因为所有的几丁质合酶在通道中都包含一个类似的环，其特征为Pro454残基（扩展数据图1b）。有趣的是，RsBcsA在相应的位置包含一个“FFCGS”基序（扩展数据图9d，e）。虽然其序列与CHSs的VLPGA基序具有一定程度的保守性，但值得注意的是，该基序中的半胱氨酸与VLPGA基序中的特征脯氨酸不同，可以采用不同于半胱氨酸或其他非脯氨酸残基的特定构象。因此，BcsA中的FFCGS基序可能与CHSs中的VLPGA门锁环在相同的模式下不起作用。

NikZ抑制几丁质生物合成的作用

PsChs1与NikZ复合物的低温电子显微镜结构，通过抑制常数（Ki）值为151.1 ± 4.8 μM竞争性抑制PsChs1活性（图4，扩展数据表1和扩展数据图7）。

正如对底物类似物所预期的那样，NikZ 通过其尿苷部分以与 UDP-GlcNAc 相同的方式与尿苷结合管结合，从而阻断供体底物的结合，到这个位置（图 3a 和 4）。此外，NikZ的羟基吡啶部分占据了反应室的很大一部分以及易位通道的入口，从而进一步阻止了供体底物进入反应室进行甲壳素生物合成（图4b）。羟基吡啶环位于易位通道的入口，并模拟一个易位前的糖单元，以诱导闸门锁控制通道的打开。它与通道入口周围的残基相互疏水作用，特别是来自QHFEY基序的Tyr433，来自VLPGA门锁环的Val452和Pro454，以及来自QRKRW基序的Trp539，以及门锁环附近的β链的Leu412。这些残基的突变不仅降低了NikZ的抑制活性，而且还显著降低了酶的活性（扩展数据图2j，k）。

整理：高放

DOI.org/10.1038/s41586-022-05244-5

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