小鼠低张性缺氧时的实验原理（富氢水改善睡眠剥夺大鼠认知功能的实验研究）

富氢水改善睡眠剥夺大鼠认知功能的实验研究

作者：李聘、罗明珠

作者单位：西南医科大学药学院，军事科学院军事医学研究院医学与作业医学研究所

营养学报2021年第43卷第3期

基金项目：“十三五”军队后勤科研项目重大专项

关键词：睡眠剥夺、氢、认知障碍

《中国睡眠研究报告（2022）》显示，过去10年国人的入睡时间晚了两个多小时，睡眠平均时长从2012年的8.5小时缩减到2021年的7.06小时。调查显示仅35%国人睡眠时间达到了8小时，新手妈妈、学生、职场人士睡眠问题突出。

睡眠问题已经成为各个年龄段、各种人群都面临的一大问题。

睡眠剥夺是指机体因各种因素导致部分或全部正常睡眠量丧失的状态，简单来说就是睡得不够。其可导致包括认知功能障碍在内的一系列身体机能下降，表现为焦虑、警觉性下降、反应迟缓等。由于社会竞争压力增大和生活方式的改变，多数成年人都存在着不同程度的睡眠剥夺。

睡眠剥夺会导致学习记忆受损，工作效率下降，严重时甚至还可能导致事故发生，因此，开展睡眠剥夺致认知障碍干 预措施的研究有着重要意义。

氢是一种小分子化合物，穿透力极强，容易穿透皮肤和黏膜进入细胞；同时，氢作为一种还原剂，参与体内氧化还原反应，可以选择性清除体内氧自由基。

因此，氢被广泛应用于医学各领域的研究中。目前，常见的给氢途径有静脉滴注富氢生理盐水、吸入氢和饮用氢水。但富氢生理盐水滴注和氢吸入在日常使用中并不方便，使用受到一定限制。

相比而言，直接饮用氢水会更加便捷。研究显示，氢能减少炎症因子的表达，提高创伤性脑损伤的存活率，发挥神经保护作用 ；也可以通过减少促炎因子的表达，降低氧化应激水平来改善抑郁症状。另有研究表明，氢可以减轻辐射引起的认知下降和海马损伤。

但氢能否对睡眠剥夺所致海马损伤具有改善作用尚未明确，鉴于氢对神经系统疾病的防治作用，本实验拟开展氢对睡眠剥夺所致大鼠认知障碍改善作用及机制研究，为睡眠剥夺所致认知障碍的防治提供新的思路。

西南医科大学药学院，和军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所的李娉、罗明珠等在营养学报上发表了题为《富氢水改善睡眠剥夺大鼠认知功能的实验研究》的综述，探讨氢对睡眠剥夺认知障碍的保护作用及分子机制。

1 材 料 与 方 法

1．动物饲养、干预及处理

SD 大鼠 34 只， 采用随机数字表法分为对照组（CON）、模型组 （SD）、干预组（SD HRW），对照组 12 只，其余两组各 11 只，进行 1w 的适应性喂养。适应性喂养结束后，开始正式试验，每日早晚 8 时灌胃， 每次 3ml，其中对照组和模型组采用纯水灌胃， 干预组采用富氢水灌胃，氢浓度为 0.8 mmol/L。 干预第 11d 开始，进行水迷宫游泳训练，连续 4d， 随后建立睡眠剥夺模型，SD 组和 SD HRW 组睡眠剥夺 72h，CON 组不剥夺，建模期间仍进行干预。

睡眠剥夺 72h 后，进行最后一次水迷宫实验，并采用该数据作为最终成绩。然后按照 0.4 ml/100g 的剂量腹腔注射 10%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹腔主动脉采血，断头，冰上取海马、前额皮层。全血采用肝素钠抗凝，10 000g，离心 1 min，收集血浆备用。该实验获得军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所实验动物福利伦理委员会批准。

2．睡眠剥夺模型

正式实验 2w 后，采用多平台水环境法制备睡眠剥夺模型，水温保持在 22℃左右，水面高出平台约 1cm。大鼠可以在平台上站立，可自由摄取食物和水，但当大鼠进入快速动眼睡眠时，由于骨骼肌松弛掉入水中而惊醒，造成睡眠剥夺，连续 72h。

3．Morris 水迷宫试验

利用 Morris 水迷宫训练仪系统对大鼠的活动进行全程跟踪。实验室挂窗帘避光，试验时水迷宫外所有参照物保持不变。正式实验前 1 日，大鼠在无平台的水迷宫中自由泳 1 min，熟悉环境。

参照 Liu 等方法并进行改进。造模前 4 d 进行水迷宫学习，每天灌胃 1h 后，连续 4 d，按第Ⅰ至第Ⅳ象限顺序将大鼠面壁放入水池中，每次入水间隔时间 20 min。系统自动录像记录大鼠入水后找到并爬上平台（停留时间＞3s）的游泳时间，即逃避潜伏期、游泳总路程。每次观察时间为 60 s，如在 60 s 内动物未能找到平台，则由实验者将其引导至平台，并在站台上停留 10 s， 潜伏期记为 60 s。逃避潜伏期越短，表明认知能力和记忆巩固越强。剥夺 72h 后，所有大鼠进行末次定位导航实验作为最终成绩。

4．ELISA 检测

按照组织重量/体积=1:9 加入裂解液，制成 10%匀浆，3000 r/min 4℃离心 10 min，取上清，采用 BCA 法对组织蛋白定量。按照试剂盒说明书，检测海马、前额皮层中 GSH-Px、SOD、MDA 水平，海马中 BDNF、TrkB、 IL-17 及血浆中 IL-17 水平。

5．荧光定量 PCR

随机挑选各组 6 个样本。称取相同体质量海马组织后，采用 Trizol 法提取总 RNA，然后进行 qPCR 测定各样本 BDNF、 TrkB 基因表达水平。

2 研究结果

统计学分析采用 SPSS 20.0 统计软件进行分析。统计数据用 x ±s 表示。方差齐性检验后组间采用单因素方差分析检验。检验水准 α=0.05。

1．氢对睡眠剥夺大鼠空间记忆学习能力的影响

睡眠剥夺 72h 后，模型组大鼠的逃避潜伏期 和总路程明显比对照组和氢干预组长（ P ＜ 0.01），而对照组与氢干预组之间无差异（P＞ 0.05）。

2．氢对氧化应激水平的影响

氢对大鼠海马氧化应激水平的影响： 与对照组相比，模型组海马中 MDA 含量明显增加 （P ＜ 0.01），同时， GSH-Px、 SOD 表达降低 （P＜ 0.01）；与模型组相比，氢干预组 MDA 含量明显减少（P＜ 0.01），GSH-Px 和 SOD 表达明显增加（P＜ 0.01）。

氢对前额皮层氧化应激水平的影响：与对照组相比，模型组前额皮层中 MDA 含量明显增加（P＜ 0.01），GSH-Px、SOD 含量明显减少 （P＜ 0.01）；与模型组相比，氢干预组 MDA 含量明显减少（P＜ 0.01），GSH-Px 和 SOD 含量明显增加（P＜ 0.01）。

3．氢对 IL-17 水平的影响

与对照组相比，模型组海马与血浆中 IL-17 水平显著提升（P＜ 0.01），与模型组相比，氢干预组海马、血浆中 IL-17 水平明显下降（P＜ 0.01， P＜ 0.05）。

4．氢对海马组织中 BDNF、TrkB mRNA 表达的影响

与对照组相比，模型组 TrkB 的表达明显降低（P＜ 0.05），与模型组相比，氢干预组表达有所升高（P＞ 0.05）；与对照组相比，模型组 BDNF 明显降低（P＜ 0.01），与模型组相比，氢干预组 BDNF 明显升高（P＜ 0.01）。

5．氢对海马组织中 BDNF、TrkB 蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组 BDNF、TrkB 蛋白表达水平显著降低（P＜ 0.01）；与模型组相比，氢干预组BDNF、TrkB 水平明显提高（P＜ 0.01）。

3 讨论

自 2007 年 Ohsawa 等报道了分子氢对大脑缺血再灌注损伤模型大鼠的治疗作用后，氢的生物学作用研究受到关注。研究表明，氢可以减轻神经元损伤，延缓神经退化。研究表明，急性睡眠剥夺 24 h 或者 72 h 都会损害空间学习和认知功能 ，其导致认知功能障碍可能与神经元损伤、突触的可塑性降低有关。

本实验 Morris 水迷宫结果显示，模型组的游泳总距离和潜伏期均明显高于对照组，而氢干预组的指标较模型组明显下降，说明睡眠剥夺会降低大鼠的学习认知能力，而氢能改善海马认知功能。

睡眠剥夺会导致脑部的氧化应激。考虑到海马和前额皮层在认知功能中的作用 ，本实验结果显示，睡眠剥夺会降低 SOD、GSH-Px 的表 达，增加 MDA 的产生，而给予氢干预后明显缓解， 和 Liu 等报道的结果一致，说明氢能提高体内 抗氧化功能，降低氧化损伤，防止大分子过氧化。

研究表明，睡眠剥夺期间，血浆中 IL-1、IL-6、 IL-17 浓度显著增加，睡眠恢复后，IL-1、IL-6 恢复正常水平，但 IL-17 仍高于正常水平，另外，IL-17 作为一种炎性因子还能通过刺激 p38 MAPK, PI3K/Akt 和 NF-κB 的激活促进其他炎症因子的表达 ，提示 IL-17 在睡眠剥夺引起的炎症反应中可能有一个关键性作用。

本研究显示， 给予睡眠剥夺大鼠氢干预后，IL-17 表达下降，说明氢能缓解睡眠剥夺引起的炎性反应，缓解大脑损伤。BDNF 是海马含量最多的神经营养因子，参与 神经元的生长发育和突触的可塑性调节，当 BDNF 与其特异性受体酪氨酸激酶受体 B（TrkB）结合，调节 Ca 2 水平的信号转导途径启动，钙依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表达增加，进而调节神经元的生长和发育 。

另外， BDNF 介导的 PI3K/Akt/mTOR 信号通路激活参与长时程增强和学习认知功能 。本研究检测了海马组织中 BDNF、TrkB 的表达，虽然氢干预组与模型组之间没有显著性差异，但给予睡眠剥夺大鼠氢水后， TrkB 的转录水平有升高趋势，尤其是可以显著提高海马组织 BDNF 的 mRNA 表达，且有统计学差异；进一步检测表明，氢可以增加海马的 BDNF、TrkB 在蛋白水平的表达，提示氢改善睡眠剥夺大鼠认知功能可能与增加 BDNF、TrkB 的表达有关。

4 结论

综上，本研究建立了睡眠剥夺大鼠模型，并验证睡眠剥夺会降低大鼠的认知功能；而氢可通过降低睡眠剥夺大鼠的炎症反应、改善其抗氧化功能及上调 BDNF、TrkB 的表达改善认知功能。但氢减缓认知功能损伤具体作用靶点及其如何在脑区发挥上调 BDNF 详细机制还有待进一步研究。

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