pcr产物中有几种(PCR产物直接克隆)

【实验目的】

(1)掌握PCR产物直接克隆的T载体连接法的原理。

(2)学习并掌握采用T载体连接法进行PCR产物的直接克隆的方法及操作步骤。

【实验原理】DNA Taq聚合酶在PCR反应过程中能够在PCR产物的3’末端加上1个非模板依赖的A,而T载体是1种带有3’T突出端的载体,在连接酶的作用下,T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的A-T配对,可以把PCR产物直接插入到T载体的多克隆位点中,形成含有目的片断的重组载体,达到对PCR产物直接进行重组克隆的目的。常用的T载体有pUCm-T、pMD19T等。pUCm-T载体是在pUC19载体的基础上改造而成,是大小为2.7kb的双链DNA质粒,有1个复制起点、1个氨苄青霉素抗性基因和1个多克隆位点,适合于DNA片段的克隆、DNA测序、对外源基因进行表达等。由于核载体在lacZ领域中含有多克隆位点,因此在转化lacZ缺陷型宿主细胞(如JM109等)后,在含有IPTG、X-gal的平板上培养时,很容易通过蓝白筛选判断载体中有无DNA片段的插入。同时,还可以通过载体上的lac启动子表达外源基因、对插入载体中的DNA片段进行测序等。进行DNA测序时,可以方便地使用M13系列的通用引物。pUCm-T载体如图12.1所示。pMD19-T载体是1种高效克隆(TA克隆)PCR产物的专用载体,由pUC19载体改建而成,在pUC19载体的多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点,用EcoRⅤ进行酶切反应后,再在两侧的3’端添加“T”。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加1个“A”的特性,所以采用T载体可以直接进行PCR的产物连接和克隆。pMD19-T载体的β-半乳糖苷酶的表达活性更高,菌落显示蓝色的时间缩短,颜色更深。因此,克隆后更容易进行克隆体的蓝白斑筛选。pMD19-T载体如图12.2所示。重组质粒可以通过转化大肠杆菌后,经α-互补筛选或蓝白斑筛选,对筛选出的白斑菌落可进一步用酶切电泳或PCR法进行鉴定。对于重组的质粒可以使用载体多克隆位点上的2个PstⅠ酶切位点进行PstⅠ单酶切鉴定,也可以使用廉价且高效的EcoRⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、HindⅢ等内切酶进行双酶切鉴定。构建完成的质粒可以通过质粒上的正反2个M13引物位点进行测序或通过T7promoter上的T7引物位点进行测序;可以利用T7 RNA polymerase promoter进行体外转录,用于探针标记等。

pcr产物中有几种(PCR产物直接克隆)(1)

图12.1 pUCm-T载体的图谱

pcr产物中有几种(PCR产物直接克隆)(2)

图12.2 pMD19-T载体的图谱

【实验材料、试剂及仪器】

1.实验材料经回收的PCR扩增DNA片段、T载体。

2.实验试剂

(1)T4连接酶。

(2)10×T4连接酶缓冲液。

(3)无菌水。

3.实验仪器

生化培养箱(全班1台)

制冰机(全班1台)

冰盒(每2人1个)

0.5mL无菌离心管(每人1支)

移液器(每2人1套)

10μL无菌吸头(若干)

台式低速离心机(每8人1台)

【实验步骤】

(1)在0.5mL离心管中加入(反应体系20μL):PCR回收产物10μLT载体1μL10×T4连接酶缓冲液2μLT4连接酶1μL无菌水6μL

(2)3000r/min短暂离心混匀,16℃连接2~4h。

【实验注意事项】

(1)连接反应温度要适中。若温度过高,黏性末端之间形成的氢键不稳定;若温度过低,会影响连接酶的活性。

(2)使用Tip头吸取酶液过程中应准确,避免Tip头外带有过多的酶。

(3)T4DNA连接酶在冰上长时间放置不稳定,最好在使用时取出,用后立即放回-20℃冰箱。

【实验讨论】问题:PCR产物可以直接进行连接反应吗?

答:PCR产物片段需先回收纯化,因为PCR产物中含有杂质DNA片段、残存引物等杂质,都会影响TA克隆效率。

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