蛋白原核表达技术流程,科学家发现新型胞内体机制

“针对 GPCR 介导的激酶 ERK 信号源自细胞表面的这一旧有理论,以及对于 GPCR 介导的信号通路转导的教科书模型,我们的发现带来了一些改变。”加州大学圣地亚哥分校医学院药理学系教授张瑾表示。

蛋白原核表达技术流程,科学家发现新型胞内体机制(1)

图 | 张瑾(来源:张瑾)

近日,该团队的一篇论文发在 Nature 上,此次新发现可能对药物开发产生深远的影响。目前,针对 GPCR 的药物开发以偏向性信号等概念为指导,即通过药物来选择性地激活 G 蛋白或抑制素。

但是,此次研究发现:一些受体需要借助抑制素和 G 蛋白的协同作用,来激活胞内体上的激酶,这有望改变我们对于 GPCR 药物开发的看法。

更重要的是,许多类型的癌症包括结肠癌、胰腺癌和阑尾癌,已被证明在 G 蛋白和 GPCR 中包含错误突变。

而该研究指出:胞内体上 G 蛋白介导的激酶激活,在癌症相关过程中也承担着重要作用。而这种新发现的胞内体机制,为癌症药物开发提供了新机会。

蛋白原核表达技术流程,科学家发现新型胞内体机制(2)

(来源:Nature)

蛋白原核表达技术流程,科学家发现新型胞内体机制(3)

为胞内体的激酶激活,提供有趣的新见解

据介绍,在信号受体大家族中,G 蛋白偶联受体(GPCR,G Protein-Coupled Receptors)是最大的一个受体家族,同时也是非常重要的药物作用靶点。据估计,超过三分之一的现有药物靶点由一个或多个 GPCR 家族成员构成。

除了通过激活 G 蛋白、来传导细胞信息之外,目前已知的是:GPCR 还能激活细胞外信号调节激酶(ERK,extracellular regulated protein kinases)。

同时,此前已被明确的是:在参与细胞增殖和存活的多个基因转录中,ERK 激酶信号通路都具有重要作用。

ERK 激酶信号通路的失调,与包括癌症在内的病理均有关系。因此,针对 ERK 信号通路成员的治疗干预,是癌症研究人员的重要努力方向之一。

在 ERK 激酶相关的信号通路中,尽管 GPCR 受体发挥着强大的调节作用。但是,GPCR 介导的 ERK 激酶激活机制一直是个谜。

在经典的教科书模型中,激活的 GPCR 可以将抑制素招募到细胞膜。抑制素在细胞膜上充当支架蛋白,从而招募分子机器来激活 ERK 激酶。

蛋白原核表达技术流程,科学家发现新型胞内体机制(4)

(来源:Nature)

然而,最近其他课题组的研究对这一模型发出了挑战,其提出抑制素或许是可有可无的,反而是 G 蛋白在这一过程中起着关键作用。

该课题组认为,为了更好地理解相关调控机制的关键,还需要对 GPCR 在细胞内的空间定位这一点进行考虑。因为 GPCR 不仅定位在细胞膜,其还能在抑制素的帮助下,被网格蛋白介导内吞。

而这个内吞过程,是经典的受体脱敏过程的一部分。因此,即使激动剂持续存在,受体也不会永远保持活跃。

然而,最近其他课题组的研究表明:GPCRs 在被内吞到早期胞内体之后,仍能向 G 蛋白发出信号。因此,存在着两个时空分离的 GPCR 亚群。

不过,GPCR 介导的激酶信号如何在空间上受到调节,以及这两个 GPCR 亚群如何在机理上偶联并激活 ERK 激酶,目前学界尚未完全弄清楚。

基于此,该团队研究了 GPCR 介导的 ERK 激酶信号通路转导的空间调控。为此,他们使用了一套独特的分子工具包:生物探针、纳米抗体、以及小分子肽抑制剂。

其中,生物探针由于可被基因编码所以能被定位到不同亚细胞位置;纳米抗体和小分子肽抑制剂也具备可基因编码的特征,它俩能激活或抑制特定亚细胞位置的特定 GPCR 信号。

借助这些工具以及其他方法,他们发现细胞膜上基本没有 ERK 激酶的活性。相反,GPCR 介导的 ERK 激酶信号起源于胞内体。

在激素的刺激下,GPCR 通过抑制素介导的内吞作用到达胞内体,在那里会发生 GPCR 介导的 ERK 激酶激活。同时在胞内体上,与激素结合的活化受体,也会参与到这一过程。

他们还发现:GPCR 介导的 ERK 激酶信号在胞内体激活之后,会传播到细胞核中。在那里,它会激活一些重要基因的表达,而这些重要基因可以控制细胞的生长。

与细胞膜相比,胞内体和细胞核的空间位置更为接近。基于此课题组推断:细胞利用细胞器的 3D 空间组织,并使用一条“捷径”来进行有效的受体信号转导。

此外,该研究还确定了这一机理:即胞内体上 ERK 激酶的激活,是 G 蛋白介导的事件。张瑾说:“我们的数据表明 G 蛋白介导的信号通路既可以发生在细胞膜上,也可以发生在胞内体上。”

那么,G 蛋白介导的信号通路可以起到哪些作用?具体来说,在细胞膜上可以调节细胞膜效应分子、腺苷酸环化酶、磷脂酶 C、离子通道,而在胞内体上的效应分子则包括 ERK 激酶的上游调蛋白 RAF1。

说到这里张瑾补充称:“对于抑制素参与 ERK 激酶激活这一现象,我们的数据也提供了有力支撑。然而,这是通过受体内吞实现的,而非通过充当 ERK 激酶的支架蛋白实现的。”

这表明,GPCR 向下游发出信号的方式更加多样化。同时,抑制素和 G 蛋白在协同作用之下,可以激活胞内体的 ERK 激酶。

在这一过程中,抑制素会将受体护送到胞内体,而 G 蛋白则负责招募激活 ERK 激酶的分子机器。

近日,相关论文以《内体 ERK 的非典型 β-肾上腺素能激活》(Non-canonical β-adrenergic activation of ERK at endosomes)为题发表在 Nature 上,Yonghoon Kwon 是第一作者,张瑾担任通讯作者。

蛋白原核表达技术流程,科学家发现新型胞内体机制(5)

图 | 相关论文(来源:Nature)

评审专家表示:“论文写得很好,为胞内体上 ERK 激酶的激活提供了有趣的见解。”另一位审稿人指出,胞内体介导的 GPCR 信号所转导的机制及其功能,是一个备受关注的问题。

而该团队提供了令人信服的数据,解决了一个重要且及时的问题,有望为开发选择性靶向胞内体信号的药物提供基本原理。

还有一位审稿人说,GPCR 一直是个有争议的课题。而该研究提出了一个简单的解决方案,这与当下人们对于信号通路区室化的理解是一致的。

蛋白原核表达技术流程,科学家发现新型胞内体机制(6)

将测试其他具有不同特征的 GPCR

据悉,在研究伊始,课题组打算用生物探针检查 GPCR 引起的细胞质、细胞膜、胞内体和细胞核中的 ERK 激酶活性。其中,Yonghoon 博士首先检查了肾上腺素在细胞质中诱导的 ERK 激酶活性。

和预期一样的是,肾上腺素能够显著地诱导细胞质 ERK 激酶的活性。然而,当他观察细胞膜时,一个令人惊讶的现象浮现:尽管表皮生长因子可以引起同一生物探针的强烈反应,但是肾上腺素并未让激酶 ERK 生物探针产生任何显著的反应。相反,肾上腺素激活了胞内体的 ERK 激酶活性。

针对这一现象,他们提出了这一假设:β-肾上腺素能通过受体 β2AR 激活 ERK 激酶信号,并通过内吞受体特异性地起作用。

后来,他们使用三种方式验证了这一假设,并表明对于 GPCR 介导的胞内体上 ERK 激酶活性来说,抑制素所介导的受体内吞必不可少。

鉴于 Gαs 在 β2AR 信号转导中的重要性,对于 Gαs 能否参与调节内体 ERK 激酶的活性,课题组也进行了测试,结果表明该过程需要的是活性的 Gαs。

然后,他们将纳米抗体和小分子肽抑制剂定位在胞内体上。这时,他们发现肾上腺素激活的胞内体上的 ERK 激酶活性需要活化的、定位于胞内体的 GPCR 和 Gαs 的参与。

蛋白原核表达技术流程,科学家发现新型胞内体机制(7)

(来源:Nature)

接着,他们又提出如下假设:胞内体定位的活化的 Gαs,招募了包括 Raf 和 MEK 在内的激活 ERK 激酶的分子机器。

在一系列实验中,研究团队开始对上述假设进行验证。详细来说,团队使用了邻近连接分析技术,和定位于胞内体的可以稳定活化的 G 蛋白的纳米抗体。

结果发现,定位于胞内体的活化的 Gαs,通过将 RAF1 和 MEK1 募集到一个信号转导复合体中,来介导 β2AR 激活的胞内体上的 ERK 激酶。

由于 ERK 激酶通路可以调节多种细胞过程,其中涉及到细胞核里 ERK 激酶活性的积累。为此,课题组检查了细胞核里的 ERK 激酶活性,是否真的位于胞内体 G 蛋白-ERK 激酶信号轴的调控之下。

这时,使用定位于细胞核的生物探针、以及纳米抗体和小分子肽抑制剂,他们发现 ERK 激酶信号可以从胞内体传播到细胞核。

由于 ERK 激酶可以调节基因表达,接下来他们研究了胞内体 Gαs 启动的细胞核 ERK 激酶信号到底会给 ERK 激酶调控基因的转录带来哪些影响。

有趣的是,课题组发现肾上腺素刺激可以选择性地诱导 c-Myc 表达。此外,通过抑制胞内体 G 蛋白的活性,肾上腺素刺激的 c-Myc mRNA 的表达会被减弱。

这表明,胞内体 Gαs-ERK 激酶信号转导,在调控 ERK 激酶靶基因的选择性表达中起着重要作用,这也和胞内体对 ERK 激酶靶基因转录的影响一致, 即胞内体上 Gαs 介导的 ERK 激酶信号可以调节细胞的增殖。

蛋白原核表达技术流程,科学家发现新型胞内体机制(8)

(来源:Nature)

基于此次研究,张瑾与同校的 Roger Sunahara 教授课题组合作,研究了一种血细胞分化受损的疾病——骨髓增生异常综合症。

之前的研究发现,与之相关的剪接因子 U2AF1 和 SRSF2 的突变,可以选择性地增加 Gαs 的长剪接形式的表达,并通过 ERK 激酶、而非经典的 cAMP/PKA 信号通路,去启动异常信号的转导。这让他们得以测试胞内体 G 蛋白-ERK 激酶通路的疾病相关性。

他们发现只有与这种疾病相关的长的 Gαs 剪接变体,可以调控胞内体和细胞核的 ERK 激酶活性。

此外,对于所提出模型的潜在通用性,课题组也非常感兴趣。在此次 Nature 论文中,他们测试了四种 GPCR。

目前,其正在测试其他具有不同特征的 GPCR,例如那些不容易经历抑制素介导的内吞作用的受体。同时,也将测试此前开发的偏向性激动剂。

就当下的研究来说,其只展示了细胞信号转导的时空调控的其中一个例子。该团队的新设想是:所有细胞生化活动都会在空间里组织成“有活性的架构”,而癌症等疾病状态反映了这种架构的重组和重构。

对于这一新课题,研究团队正结合生物探针、超分辨率成像和靶向生化扰动,以在不同尺度上来探索这种架构。

支持:Bao

参考资料:

1.Kwon, Y., Mehta, S., Clark, M. et al. Non-canonical β-adrenergic activation of ERK at endosomes. Nature 611, 173–179 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05343-3

,

免责声明:本文仅代表文章作者的个人观点,与本站无关。其原创性、真实性以及文中陈述文字和内容未经本站证实,对本文以及其中全部或者部分内容文字的真实性、完整性和原创性本站不作任何保证或承诺,请读者仅作参考,并自行核实相关内容。文章投诉邮箱:anhduc.ph@yahoo.com

    分享
    投诉
    首页