实验小窍门（如何让你的转化实验事半功倍）

背景介绍

遗传转化作为基因功能研究的一个重要手段，它的成功与否往往取决于起始实验材料或外植体。下胚轴、子叶、叶、茎和根等，这些外植体都是转化过程的起始材料，不同的外植体对转化和再生的影响较大。伯小远下面将带着大家一起探讨外植体的选择和影响外植体选择的不同因素。

植物遗传转化

· 转基因的一般策略

植物遗传转化是一种将DNA从一个生物体转移到另一个生物体基因组的科学方法。外源基因合并到宿主植物基因组中，并代代遗传。转移的基因称为转基因，产生的植物称为转基因植物。

在植物中，基因转移的方法分为两类：(a)载体介导的基因转移，(b)直接或无载体介导的基因转移。基因转移的常用方法如图1所示。载体介导的基因转移可通过农杆菌介导的转化或以植物病毒为载体进行。农杆菌是一种天然的土壤细菌，能够感染各种植物，引起冠瘿病。它具有自然的转化能力。当农杆菌通过伤口或其他方式自然感染植物细胞时，它会转移其T-DNA的拷贝到植物细胞中，其中T-DNA是在其Ti（肿瘤诱导）质粒上携带的一小部分DNA。

图1.植物中常用的基因转移方法示意图

图2.农杆菌介导的植物遗传转化原理

直接或无载体基因转移是指将感兴趣的裸DNA转移到植物基因组中的方法。直接或无载体基因转移的方法主要有三种：(a)物理方法，包括电穿孔法、粒子轰击法、微注射法、脂质体包封法和碳化硅纤维介导的基因转移；(b)含有聚乙二醇(PEG)介导、二乙基氨基乙酯(DEAE)右旋糖酐介导、磷酸钙沉淀和(c)细胞、组织或器官吸DNA的化学基因转移方法。大多数直接基因转移方法简单有效，已被应用于多种转基因植物的开发中。

图3.基因枪法遗传转化原理

不同类型外植体用于植物遗传转化

在植物组织培养中，正确选择外植体是遗传转化成功的关键。外植体的选择取决于培养类型和拟培养的目的，以及外植体的植物种类。以下是植物组织培养中使用的不同类型外植体的简要介绍。

子叶：子叶是种子萌发后幼苗的第一片胚叶（图4，以菜豆为例）。有花植物的分类是由子叶的数目决定的。具有一片胚胎叶或子叶的植物称为单子叶植物，具有两片胚胎叶的称为双子叶植物。玉米是粒子轰击法转化技术中最常用的单子叶植物之一[39]。子叶培养需要与无菌生长的幼苗进行有效的芽再生。子叶从胚轴上的切除取决于用于有效再生研究的子叶的年龄。

图4.菜豆生长发育不同阶段部位介绍

叶片：在叶片培养中，取幼叶原基或未成熟的幼叶作为外植体。外植体可以从无菌种植的植物中采集，用于组织培养。叶片外植体的切除取决于成熟阶段，以保持在组织培养基中的生长潜力。

茎尖/分生组织：茎尖/分生组织培养是指茎的顶端（0.1-1.0 mm）部分，包括分生组织（0.05 -0.1 mm)，以及原叶、新生叶和相邻茎组织的培养。分生组织培养是指从茎尖切下长度小于0.1 mm的有光泽的特殊圆顶状结构的离体培养。一旦枝条直接从切除的外植体(如茎尖/分生组织)中生长出来，就可以通过将含枝条的节段分离成小段并在营养培养基上培养来进行节段繁殖。

图5.植物分生组织

花：将切除的无菌花蕾在营养培养基上培养，以产生完整的花和随后成熟的种子，称为花培养。在花培养过程中，花可以在不同的发育阶段被摘除，如原始期、授粉前或授粉后、花蕾期等。花原基或花芽培养主要用于研究花发育的基础，授粉后花培养用于研究果实发育。在花的授粉前阶段，果实通常不发育；然而，单性果实可以通过补充生长素的营养培养基来产生。

根：在根培养的情况下，从无菌萌发的种子上切下胚根根尖，在最适宜的营养培养基上培养。也可以通过切断主根尖或侧根尖并使其生根，然后在控制条件下的新鲜培养基上进行传代培养，来培养切除的根的复制品。

影响外植体选择的因素

· 外植体的年龄

外植体年龄是影响植物组织培养的重要因素。外植体的年龄在很大程度上决定了其转化和再生效率[5]。从最优条件下发育的健康供体中收集的外植体可以高效地转化为健康、可育的转基因植株。Pastori等[24]研究表明小麦品种的转化效率与供体植株年龄显著相关（r 2=0.946）。在本研究中，与80 ~ 82天龄植株[24]相比，Cadenza和Canon在70天龄植株中获得了最好的轰击转化效率。另一项研究也报道了外植体年龄对西瓜生物转化成功的影响是显著的[31]。4日龄西瓜幼苗子叶外植体转化率[98%]高于5日龄西瓜幼苗[90%]。

农杆菌介导的杨树叶片外植体在30日龄时的转化效率高于60和90日龄的杨树叶片外植体[14]。这是因为农杆菌介导的转化效率取决于叶片外植体的表面，因为幼叶表面有更多的结合位点，容易被农杆菌[13]附着。而成熟叶片的表皮细胞较为完整，附着位点数量有限，导致转化效率降低。枸杞幼龄苗（3周龄）叶片外植体的转化效率高于4、5周龄苗[15]。Villemont等人的另一种解释[36]指出，成熟种子中有少量细胞分裂，导致宿主细胞中T-DNA整合减少，从而导致转化和芽再生效率[36]的降低。

· 外植体的大小

外植体的大小是影响植株再生效率的重要因素。在植物组织培养中，大的外植体比小的外植体更适合，因为小的外植体难于培养，而大的外植体可以保留更多的营养物质和植物生长调节剂，以维持其在[33]培养条件下的生长。在玉米生物转化[10]中，12 mm大小的未成熟胚可作为胚性愈伤组织再生的最佳外植体。同样，在他们对胚胎大小的分析中，Pastori等[24]报告说，在生物学方法[24]中，作为外植体的胚胎大小应该在0.5 - 1.5mm之间。柑桔茎段(1 cm)较短(0.2 ~ 0.5 cm)的茎段再生效率更高。较大茎段的切端可再生出少量或不形成愈伤组织[21]。与短(0.5 cm)、中等(1 cm)和极长(2 cm)外植体[26]相比，长(1.5 cm)外植体的不定芽再生效果最佳。

· 外植体切除位置

植株转化和再生的效率也受到从供体上摘除外植体的位置的影响。由于供体植株的高部位比低部位年龄大，会影响离体幼苗的生长。例如，从鳞茎基部取出的外植体比从鳞茎顶部[25]取出的外植体更容易产生偶发鳞茎。用粒子轰击法[24]从幼嫩供体小麦主芽和主分蘖中收集合适的胚，可获得最佳的转化和基因表达。

Beyaz等人[4]研究了从7日龄不育亚麻幼苗下胚轴不同部位切除的外植体的基因转化效率。亚麻幼苗的下胚轴区域分为3个位置：1号位置在根的上方，2号位置在第1部分的上方，3号位置刚好在子叶下方。再生率最高的位置为1号(96.65%)，最低的位置为3号(5%)。转化后，从位置1的下胚轴区域生长的31株植株转移到土壤中，均成功生长，而从位置2开始的有6株，从位置3的下胚轴区域生长的植株转移到土壤中没有植株可以生长。

· 外植体的取向

外植体在植物组织培养基中的定位是影响植株转化和再生效率的另一个重要因素。不同外植体的方向不同，如下胚轴和芽的方向为极性或非极性，叶和子叶[12]的方向为远轴的或近轴的。极位是指生理面与介质接触的上侧，而非极位是指生理面与介质远离的上侧。远轴是外植体下表面朝下的位置，而近轴是外植体上表面朝下接触培养基[12]的位置。Mazumdar等[21]报道，当外植体的远轴端接触培养基时，其再生效率比近轴端接触培养基[21]时高两倍。类似的报告也在早期的研究中得到了证明[3, 37]。对于下胚轴外植体，极向生长比倒置或非极向生长产生更多的芽[20]。

· 外植体基因型

外源外植体的转化和再生效率也依赖于外源外植体优越基因型的选择。选择优良基因型是必要的，因为它们需要易于组织培养和转化。一些研究报道了不同基因型对转化和再生效率的影响。例如，已知一些玉米基因型主要用于颗粒轰击高效转化（Hi-II(商业基因型)[11,35]，自交H99 [23]， CG00526 [38]， Gz 643(埃及基因型)[9]，IL-3(热带基因型)[27]等)。同样，杨树的两个品种，沙叶杨和香柏杨也被确定为常规转化方法的优越基因型。在这两个基因型中，香柏树的转化率高于另一个杨树基因型[18]。

外植体预处理

外植体对农杆菌的易感性在很大程度上受植物生长调节剂(PGR)预处理的影响[19]。PGRs还能提高外植体的不定芽再生能力[22]。适宜浓度的植物生长激素不仅能诱导外植体的不定芽再生能力，而且能提高不定芽再生的频率[42]。在植物组织培养中常用的PGRs有萘乙酸（NAA）、6-苄基氨基嘌呤（BAP）、苯基噻二唑基脲（TDZ）、玉米素核糖苷（ZR）、吲哚乙酸（IAA）等。这些PGRs既可以单独使用，也可以联合使用，并辅以MS培养基。Mansur等[19]报道，共培养介质，即在MS基础培养基中添加0.4 mg/L NAA，并且叶片外植体添加1.0 mg/L BAP，子叶外植体添加25.0 mg/L BAP，与仅使用MS培养基相比，转化效率显著提高[28]。近年来，利用PGRs对药用植物南非醉茄(茄科)的节段外植体进行预处理，成功地实现了农杆菌介导的遗传转化。结果表明，在添加BAP（1.5 mg/L）的MS再生培养基中，愈伤组织的不定芽数量增加。此外，BAP（1.5 mg/L）与IAA（0.3 mg/L）联合使用能更有效地提高南非醉茄(茄科) [28]的不定芽再生数量。在具有重要经济价值的室内观赏植物——朱蕉中，在TDZ浓度为0.1 mg/L的MS培养基中，农杆菌介导的转化效率和不定芽再生率均有所提高[14]。PGRs可提高细胞分裂率[2,16]，调节宿主基因表达，或改变植物伤口代谢产物水平，这可能是农杆菌敏感性增加的一种解释[19]。PGRs诱导外植体细胞分裂可能会改变细胞壁结构，从而增加细菌附着的机会，从而增加T-DNA在宿主细胞中的转移[17,28]。

外植体的制备

组织培养开始前最重要的准备工作是外植体的表面灭菌，因为强烈建议使用无菌组织作为源材料[7,40]。表面杀菌消除了有害微生物的生长，如细菌和真菌，可以很容易在体外条件下生长。一般来说，用于表面杀菌的表面消毒剂有乙醇、次氯酸钠（NaClO）、过氧化氢、溴水、氯化汞、硝酸银、抗生素等；其中NaClO在去除几种细菌、真菌和病毒方面是最常用和最有效的[29,30]。影响外植体活力和再生能力的因素有很多，如浓度、施用时间[1]和温度[40]。例如，高浓度和长时间施用NaClO对离体种子萌发有负面影响，而低浓度NaClO对组织杀菌没有影响。对黄蛾幼苗的萌发，获得的最佳有效消毒浓度为3.75% NaClO作用15 min[42]。同样，10℃以下的NaClO（2%）对亚麻种子表面杀菌效果不佳，而30℃下3%和4%的NaClO会导致种子萌发、幼苗生长以及根和芽长下降[30]。因此，组织培养过程中的外植体灭菌是至关重要的一步。消毒剂的使用时间、温度和浓度是影响外植体活力和组织再生能力的重要因素。

小远总结

外植体的选择是成功转化和再生的最关键参数。不同外植体类型对体细胞胚的转化和发育具有不同的预期。转化频率受外植体年龄、大小、基因型和转化过程中生长调节剂预处理时间的影响较大。

好了，到这里这篇文章就结束了，细节决定成败，希望大家以后在做实验的时候能够注意好这些细节，让自己的实验能够事半功倍！

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