影响枯草芽孢杆菌发酵产酶条件（枯草芽孢杆菌发酵产物有效磷变化及常规营养成分的评定）

棉籽饼粕饲料中含有植酸抗营养因子，植酸的存在会对棉籽饼粕作为饲料的生物学效价产生一定的影响力。植酸会对动物在自身所必需的矿物质吸收利用上产生一系列的阻碍作用，如: 引发动物厌食、消瘦和生长缓慢等病症; 其次棉籽中的植酸减少了有效磷的利用率; 再次植酸还会影响动物对蛋白质的消化利用。饲料中添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。研究以产植酸酶枯草芽孢杆菌为菌种，对棉粕源生物发酵饲料进行发酵，探究其对棉粕源发酵饲料中植酸及常规营养成分的影响，为开发棉粕源枯草芽孢杆菌发酵饲料，微生态发酵饲料的科学评定和合理利用提供理论依据；为促进动物生长、生物发酵饲料的科学利用、提高饲料的利用率等提供理论支撑。

一、材料与方法

1、 试验样品及处理

棉粕、玉米粉: 均由新疆石河子天康饲料有限公司提供，粉碎，过60目筛。

2、 种子液培养

将枯草芽孢杆菌Z3 接入营养琼脂培养基，37℃培养24 h，挑取1环菌苔接入20mL(50mL三角瓶)植酸酶液体培养基，37℃，200 r/min 摇动培养15 h(一级菌种)，取1mL一级菌种接入 50 mL (150mL三角瓶) WBE 培养基，37 ℃，200 r/min 摇动培养15 h (二级菌种) 。

3、主要试剂和仪器

仪器：高压蒸汽灭菌锅（MLS–3750，日本)；电热恒温鼓风干燥箱(GZX–9246MBE，上海)；电热恒温水浴锅(DKB–501A，上海)；722型可见光分光光度计；

离心机（日立HITACHI），隔水式恒温培养箱，HH型电热恒温水浴锅；Folin 酚试剂、0.4 mol 碳酸钠溶液、0.4 mol 三氯乙酸(TCA)溶液、pH 7. 2 磷酸盐缓冲液、2% 酪蛋白溶液、100 Lg/ mL 酪氨酸溶液, 均按SB/ T1031721999 配制。

4、试验方法

4.1底物发酵处理方法

试验组底物处理：将棉粕 90g，玉米蛋白粉10g，加入500 mL三角瓶中混合均匀，然后加入30ml的蒸馏水，充分搅拌调湿，pH自然，在0.056 MPa、121℃条件下蒸汽灭菌20 min，冷却后于无菌条件下接入7mL产植酸酶枯草芽孢杆菌Z3二级种子液，搅拌均匀，三角瓶四层纱布封口，于恒温培养箱37℃静止培养72 h。发酵结束后，将发酵产物放入烘箱中, 45 ℃烘干48 h，冷却粉碎，过60目筛，装入样品袋，保存于4℃冰箱中待测。

对照组发酵底物处理：将试验底物加入500 mL三角瓶中混合均匀，然后加入30ml的蒸馏水，充分搅拌调湿，pH自然，在0.056 MPa ,121 ℃条件下蒸汽灭菌20 min，冷却后接入7ml液体培养基（不含菌种），搅拌均匀，不经发酵，直接将其放入烘箱中, 45 ℃烘干48 h，冷却粉碎，过60目筛，装入样品袋，保存于4℃冰箱中待测。

4.2指标测定的方法

常规营养指标的测定：参考杨胜主编《饲料分析及饲料质量检测技术》。

植酸酶活性的测定：植酸酶活性测定方法参GBT：18634–2009进行，并参照Sa做了适当修改。酶液用pH5.5的乙酸钠缓冲液稀释至103，取1mL于37℃预热5 min。然后加入2mol的5mmol/L植酸钠溶液，37℃ 恒温反应30min后立即加入2mL颜色终止液。室温条件下静置10min后，取3ml上清液415nm测OD值。空白对照是将酶液和终止液37℃温浴30min后再加入底物植酸钠。

植酸酶活性单位定义：样品在植酸钠浓度为5mmol/L、温度37℃、pH值5.50的条件下，每分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷为一个植酸酶活性单位（U）。

植酸含量的测定：参照傅启高（1997），《三氯化铁比色法测定植酸含量的研究》进行测定。

植酸磷含量测定：参照苏琪（1983），《植物饲料中植酸磷的含量及测定》。

蛋白酶活性的测定：方法为福林法，中华人民共和国专业标准：SB/T 10317-1999。

液化型淀粉酶的活力单位定义为：1小时内能液化1克淀粉为1克液化型淀粉的酶量。参照孙祖莉（1994）。

底物中枯草芽孢杆菌含量的测定: 采用平板计数法。

二、结果与分析

1、发酵前后底物中植酸含量及枯草芽孢杆菌菌数的变化

发酵前后植酸及植酸酶含量变化规律如下：发酵后植酸含量降低了6.84%（平均值比较，下同），差异极显著（P＜0.01）。从数据得出，产植酸酶枯草芽孢杆菌可以降低发酵棉粕中植酸的含量，但降解量很少，这应该与植酸酶活性较低有关。每克饲料中枯草芽孢杆菌数量增加7.98×107 cfu/g，差异极显著（P＜0.01）。

2、底物发酵前后营养价值的分析

发酵前后生物蛋白饲料的营养成分含量变化规律如下：发酵后DM提高了1.72%（P＞0.05），CP提高了13.7（P＜0.05），EE提高了2.95（P＞0.05）、Ca提高了16%（P＜0.01）、P提高了31.8%（P＜0.01），Ash含量降低了4.30%（P＜0.01）。从以上的数据得出，发酵前后CP、Ca较发酵前，有显著提高（P＜0.05），但差异不明显；P与发酵前相比，有极显著的提高（P＜0.01）。表明，枯草芽孢杆菌可显著提高棉粕源饲料中P含量，这应该与植酸磷的磷被不同程度释放出来，进而提高了饲料中磷含量有关。研究发现发酵后棉粕源生物蛋白饲料的营养价值都有不同程度的提高，具有很好的生产意义。

3、棉粕源枯草芽孢杆菌发酵饲料发酵前后总磷、植酸磷及有效磷的变化

以产植酸酶枯草芽孢杆菌对棉粕源饲料进行发酵，根据数据分析可知，发酵后底物中总磷有了极显著的提高（P＜0.01），植酸磷含量显著降低（P＜0.05)，有效磷含量提高45.5%，有了极显著的提高（P＜0.01），植酸磷/总磷降低13.2%，差异显著（P＜0.05)，表明枯草芽孢杆菌发酵所产生的植酸酶可以有效的降解棉粕源饲料中的抗营养因子植酸及其盐类（植酸磷），提高棉粕源饲料中有效磷的含量，但提高量不大，这应该与植酸酶活性较低有关。

4、底物发酵前后酶活性的分析

产植酸酶枯草芽孢杆菌对棉粕源生物饲料进行发酵，发酵后CP、EE、Ca、P的含量均有所提高，Ash的含量略有所降低，棉粕源生物蛋白饲料的营养价值都有不同程度的提高；发酵后植酸含量降低，总磷含量及有效磷含量提高，但提高量很少，这应该与植酸酶活性较低有关；蛋白酶活性较低，这可能与菌株诱变有关。

三、 结论

利用产植酸酶枯草芽孢杆菌对棉粕源生物饲料进行发酵，可有效地提高饲料的营养价值，降低底物植酸含量，从而对提高饲料蛋白质及矿物质等营养的利用率、降低植酸磷对环境污染，具有一定的生产意义

作者：鲍振国