单细胞转录组测序解决的问题（6单细胞测序）

原文转自：一起实验网

对于该方法和思路适用于其他疾病。
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早！今天小编和大家分享一篇2022年1月发表在Comput Biol Med杂志（一区，IF=6.698）的文章。随着单细胞测序的成本降低，只有转录组的生信分析又太单调，为什么不试试单细胞 转录组呢？目前单细胞 转录组已经不少了，但再加一个免疫细胞方向，是不是文章更上档次和与众不同了。在这篇文章中，作者先将单细胞数据集进行分析得到肺癌中T cell簇，进而分析T cell和其他细胞簇的相互作用及T cell的时间轨迹。将T cell的标志基因与转录组中的差异表达基因取交集得到差异表达的T cell 免疫相关基因，并基于他们构建了肺癌新的预后模型。根据这篇文献思路，我们可以在单细胞数据分析在不同疾病中的重要免疫细胞，从细胞水平和基因层面探究新的预后模型或生物标志物。

背景和方法

肺癌在全球范围内呈上升趋势，是癌症死亡的主要原因。近几十年来，越来越多的研究使用RNA-seq数据探索了肺癌的潜在预后标志物，并提高了我们对肿瘤发生和进展的理解，但这些预后特征是基于RNA-seq数据，它无法检测肿瘤样本中确切的细胞和分子变化。单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够在单细胞水平上测量基因表达，并揭示单个细胞或同源细胞类型中基因表达的异质性。

方法

1. 肺癌的scRNA-seq数据集来自之前的研究-Single-cell RNA sequencing reveals distinct tumor microenvironmental patterns in lung adenocarcinoma。从TCGA数据库下载肺癌的RNA-seq数据和临床病理学特征。此外，GSE68465从GEO数据库下载。

2. 处理并分析单细胞数据来鉴定各类细胞簇，降T cell的标志基因进行功能富集分析，及T cell与其他细胞簇的相互通讯的强度和次数和T cell的伪时间序列分析。

3. 利用TCGA-LUAD的RNA-seq数据得到DEGs，与T cell的标志基因取交集。基于交集基因构建了肺癌的预后模型。

4. 利用ESTIMATER和CIBERSORT工具分析了预后模型与肺癌的肿瘤微环境的关系。

1.肺腺癌的细胞构成

通过分析单细胞数据得到了25个细胞簇（图1A-1C）。随后通过标记基因鉴定出9种细胞类型（图1D）。图1E显示了9种细胞类型中前2名标志基因表达的特征图（图1E）。图1F显示了9种细胞类型的top1标志基因表达水平。

图2A显示了9种细胞类型的前5名标记基因的热图。图2B显示了CD4 T细胞中高表达的CD4、SELL、CCR7、ITK和CD8 T细胞中的高表达CD8A，CD8B，CD27，CRTAM。随后，作者再次对T cell簇进行了亚聚类和注释，T cell被分为12个亚组（图2C），CD4 T细胞和CD8 T细胞的细胞簇如图2D所示。后续作者又分析了两个细胞簇中标记基因的表达水平（图2E-2F）。

2.与scRNA-seq中T细胞相关的富集分析

作者将T cell内的标志基因进行了功能富集分析，富集的条目均于T cell相关（图3A-3B）。此外，还根据特定的信号通路和配体-受体相互作用推断了细胞-细胞通信网络，发现TNF-TNFRSF1B在TNF信号通路通信网络中起着至关重要的作用（图3C-3F）。

3.与scRNA-seq中T细胞相关的转录因子调控网络

SCENIC的分析预测了T细胞中转录因子的关键调控网络。RUNX3，GATA3，IRF4，TBX21和EOMES（五个核心TF）将成为控制LUAD-Tcell的核心枢纽（图4A-4B）。利用Cytoscape可视化预测的TFs及其靶基因，构建基因调控网络（图4C）。

4.LUAD病变中T细胞成熟的轨迹

使用Monocle软件进行了伪时间序列分析，结果表明，4个簇大致可分为5种分化状态（图5A-5B，5D），图5C是细胞分化的时间轴，颜色越深，发育阶段越早。结果表明：簇0，1的细胞处于发育早期，簇3处于发育的末期。使用BEAM来寻找以分支依赖性方式调节的基因。热图显示了两个谱系在同一时间点的变化。图5E和5F显示了当分支1和分支2中的细胞分别执行不同的基因表达程序时差异表达基因的变化。图5E表示分支1的差异表达基因变化。这些基因分为四类，分别与磷脂外排、体液免疫应答、蛋白质折叠和伴侣结合等相关。图5F显示了分支2的差异表达基因变化。这些基因被分为四类，分别是肌动蛋白丝组织、细胞质翻译、蛋白质折叠、体液免疫应答等。这两个分支点都与体液免疫反应、对细菌的防御反应和蛋白质折叠有关。

5.预后模型构建与验证

利用TCGA-LUAD的RNA-seq数据得到821个DEGs，与T cell的标志基因取交集。基于交集基因使用单因素Cox LASSO 多因素Cox构建了肺癌的预后模型。通过LASSO鉴定了49个基因（图6A-6B）。多因素Cox得到9个预后相关基因（ASZ1、CCDC85B、CCL20、MAPK1IPL1、MYO6、RHOQ、ST13、TLE1和TMEM11）。基于9个预后基因的系数，计算风险评分中值将所有患者分为高风险组和低风险组（图6C）。生存曲线显示，与低风险组患者相比，高危组患者的OS更差（图6E）。此外，它还显示，在预测TCGA队列中这些个体的OS方面，风险评分具有良好的表现（1年，3年和5年OS的AUC：0.800，0.753和0.691）（图6F）。此外，在GSE68465队列中观察到类似的结果（图6G-6I）。

将模型结果将代入单细胞数据。图7A的点图显示了单细胞数据中九个预后基因的表达。图7B的散点图显示了具有伪时间值的9个预后基因的动态表达。

6.高危和低危人群之间的临床相关性、富集分析

通过单因素Cox 多因素Cox筛选了风险评分作为肺癌患者的独立预后因素（图8A-8B）。在多因素Cox中发现显著的变量被输入到列线图中。最后，年龄、性别、分期、T、N、M和风险评分被纳入列线图（图8D）。然后，将每个变量的分数组合成一个总分，预测3年和5年后OS 的概率（图8E-8F）。校准曲线显示，列线图预测与实际观测结果在3年和5年的生存概率中具有令人满意的一致性。此外，进行了GSEA分析，以确定两组之间最显着的富集途径。发现高危组的基因在亚油酸代谢、肠道免疫网络IgA产生和药物代谢细胞色素P450中显着富集（图8G）。然而，低风险组的基因在剪接体、癌症通路和细胞周期中显着富集。高危组和低危组的TIDEE评分存在差异。低危组TIDEE评分较高，低危组患者免疫治疗效果较差，高危组患者免疫治疗效果可能更好（图8C）。

7.LUAD与免疫细胞浸润和免疫检查点的相关性

低危组肺癌组织的免疫评分、基质评分和总体ESTIMATE评分较高，表明低危组肺腺癌肿瘤的比例较低（图9A）。使用P<0.05的CIBERSORT工具，共筛选了22个肿瘤浸润免疫细胞（图9B）。结果显示，CD4记忆激活T细胞、调节性T细胞（Tregs）和巨噬细胞M0在高危组中表达较高（P < 0.05），而单核细胞、静息树突状细胞和静息肥大细胞在低危组中表达较高。此外，我们分析了高风险或低风险组中免疫检查点的差异（图9C）。TNFSF9、TNFSF4、TNFRSF9、TNFRSF4、PVR、PDCD1、LDHB、LDHA、LAMA3和IL23A在高危组中表达较高（P < 0.05），而TNFSF18、PTPRC、IL12B、CD80、CD40LG、CD28在低危组中表达较高。最后，进一步评价免疫浸润和免疫检查点对肺癌患者临床预后的影响。结果显示，低危组单核细胞在生存时间方面与肺癌患者预后不良有关（图9B）。CD40LG、CD80、IL12B和PTPRC低危组与LUAD患者生存时间预后不良有关，IL23A、LDHA、LDHB、PVR高危组与有生存时间的LUAD患者预后不良有关（图9C）。这些结果表明，肿瘤浸润免疫细胞可能在肺癌的临床过程中发挥重要作用。

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