vcf文件如何编辑,实操合并VCF文件的几种方法及注意事项

背 景

在基因组分析领域的很多不同场景中,需要合并VCF文件。

VCF文件。简单来说,就是记录样本基因型的文件。但多数VCF文件不只记录了基因型,也包含有关该基因型的来源的细节。

其它文件。VCF文件的上游是BAM文件,主要记录Reads与参考基因组的比对信息;更上游的,就是FASTQ测序数据,以及物种的参考基因组

不同类型的VCF文件。VCF文件有单样本的、多样本的;也有普通VCF文件 (只记录变异,未测到的、野生型的都不记录),及GVCF文件 (野生型的、变异的都记录,未测到的不记录)。

vcf文件如何编辑,实操合并VCF文件的几种方法及注意事项(1)

一个典型的GVCF文件

因此,本篇文章的使用者,需要首先了解GVCF文件与普通VCF文件的不同。因为二者对应的生信处理方法也非常不同。但具体有哪些不同,这里不再继续讲,可自行在网络资源上按照相应的关键词检索。

合并VCF文件需要注意的问题。VCF文件有时是多个样本、多个个体、或多个病例的合并;有时是不同染色体区域的VCF合并。上述每个场景都涉及不同的软件、程序,甚至算法,需要非常小心、谨慎地操作。

合并:不同样本的GVCF文件

GATK的CombineGVCFs GenotypeGVCFs

上面2个程序是一套组合,不可拆分,不可单独使用。

那为什么GATK开发者将二者分开呢,推测有两个原因:① 二者分别有些特定的参数;② 第1个程序非常耗时,第2个程序相对较快、但算法复杂。这个问题对使用者也无关紧要。

#合并队列中每个样本的每一个变异(GVCF文件) gatk CombineGVCFs \ -R $ref \ $(foriin`tail-n 2metadata.txt|cut-f1`;doecho"--variant${i}.hg38.raw.g.vcf";done)\ -Ocohort.g.vcf.gz #获取具体基因型,完成变异Calling gatk GenotypeGVCFs \ -R$ref\ --dbsnp${dbSNP}\ --variantcohort.g.vcf.gz\ -OGenotype.cohort.dbSNP.g.vcf

当样本很多、数据量也大时,CombineGVCF程序很消耗内存,并且一旦中断(文件不全)就得重新来。其"-L"参数 (如"-L chr1:1-10000") 也不推荐使用 (否则GenotypeGVCFs步骤可能报错),但"-L chr1"没问题。

解决方法:① 限制内存:用"--java-option Xmx20g"等;② 分染色体,用"-L chrX"等。③ 组合使用①和②。

需要了解的是,GenomicsDB可以替代:CombineGVCFs GenotypeGVCFs,将多个样本GVCF处理生成一起的工作空间。两种方案各有各的优缺点。

根据GATK官网的描述,GenomicsDB更适用于几百个样本以上的情形。

合并:不同染色体区域的VCF文件

cat chr.list.25 # chr1 # chr2 #chr3 # ... # chr22 # chrX # chrY #chrM gatk MergeVcfs \ $(for i in `cat chr.list.25 | cut -f 1 `; do echo "-I Genotype.cohort.${i}.dbSNP.g.vcf " ;done) \ -OGenotype.cohort.dbSNP.g.vcf

MergeVcfs与CombineGVCFs不同。前者用于单纯地合并:样本相同、位点独立的VCF文件。如:同一个(或一组)样本的不同染色体的结果。

不像CombineGVCFs,MergeVcfs不做"gVCF block"的计算。此外MergeVcfs会检测两个VCF文件里的样本名是否相互"match"。

如果只查看MergeVcfs程序的介绍,根本看不出来它的用法的特点 (例如:对GVCF文件的合并可能无效),那么必然容易踩坑:

MergeVcfs (Picard) - Combines multiple variant files into a single variant file.

事实上,MergeVcfs及其等价的程序 (GatherVcfs) 不可用于合并不同样本的GVCF文件。但用来合并不同基因组区域的文件非常方便。

此场景除了MergeVcfs、GatherVcfs外的其它程序

vcf-concatsample1.chr1.vcfsample.chr2.vcf...>sample1.chrAll.vcf bcftoolsconcatsample1.chr1.vcfsample.chr2.vcf...-osample1.chrAll.vcf

其中,通过conda安装的vcftools,可能不带vcf-concat等程序。从这一点看,bcftools更方便

1个经验是:既然有GATK的MergeVcfs可用,那就尽量不用vcftools或bcftools,否则可能踩到另一个坑:不同程序对VCF文件的索引格式的要求不同、VCF的"FORMAT"列等也可能改变。

合并:不同样本的普通VCF文件

普通VCF文件只记录变异,即:① 无0/0基因型 (测序测到了、但未变异,即"Wild type") ;② 无"./."基因型 (即"缺失",测序未测到,即"No call") 。

对不同样本的⽂件合并,共有位点会合并统计;非共有位点若在某1个样本中无变异,则会⾃动记为缺失 ("./.") 。

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1个典型的普通VCF文件 (只查看了第9、10列)

vcftools和bcftools在使用之前一般都需要对VCF文件:压缩、索引 (略)。

vcf-merge#略 (对于连软件安装都麻烦的程序) bcftoolssample1.vcfsample2.vcf...-osample.all.vcf

vcf文件如何编辑,实操合并VCF文件的几种方法及注意事项(3)

vcf-merge重新计算了AC、AN等指标的值

合并分型质量 ("QUAL"列) 时,vcf-merge取了平均取值,bcftools取了最⼤值, (下图的)gatk CombineVariants (不是CombineGVCFs,也不是MergeVcfs/GatherVcfs)取了最⼩值 (gatk4)

图片来源:https://wenku.baidu.com/view/a0ecad5602f69e3143323968011ca300a7c3f643.html

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gatk CombineVariants (GATK4已无此程序)

# 压缩、索引单个VCF文件 lssorted.*.vcf|whilereadid;do bcftools view $id -Oz -o $id.gz bcftools index $id.gz done #合并 bcftoolsmerge--threads8-mid-Ozsorted.*.vcf.gz\ -obcftools.merged.103samps.vcf.gz #-m,--merge(关于多等位基因)Allowmultiallelicrecordsfor<snps|indels|both|all|none|id>,seemanpagefordetails[both] # -O, --output-type <b|u|z|v> 'b' compressed BCF; 'u' uncompressed BCF; 'z' compressed VCF; 'v' uncompressed VCF [v] # gVCF参数(可能不适用于gVCF文件): # -g, --gvcf <-|ref.fa> merge gVCF blocks, INFO/END tag is expected. Implies -i QS:sum,MinDP:min,I16:sum,IDV:max,IMF:max #测试某个位点 # zcatbcftools.merged.103samps.vcf.gz|grep'112626' #有返回结果。但无DP等信息 # 索引合并后的文件 bcftoolsindexbcftools.merged.103samps.vcf.gz&

bcftools merge虽然有"--gvcf"参数,但根据之前的测试,可能不适用于对gVCF文件的合并。

总 结

总之,① 合并VCF文件要区分其文件类型,如:是否为gVCF文件,是否为基因组的不同区域,其内部的样本名称等;② 考虑到整个流程的兼容性和流畅性,建议当GATK有相应的工具时,优先使用之;③ 其它场景可依次考虑:bcftools、vcftools。

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