新手怎么做rip 实验（实验基础克隆筛选攻略）

辛辛苦苦做完克隆，最后一个克隆没长咋办？

还能咋办？找点攻略看看再做一次呗...

那如果长了满满一板怎么办？

这个好办，下面就是攻略。继续往下看...

1. 蓝白斑筛选

蓝白斑筛选是阳性克隆的筛选方法之一。在这种方法中，片段被克隆进多克隆位点内（MCS），而MCS区位于基因lacΖα内部，也就是说成功克隆的载体，其lacΖα基因是破坏了的。

那么lacΖα基因是干嘛的呢？

lacΖα序列编码的α-肽是β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的功能单位。在lacΖΔΜ15 突变的大肠杆菌，空载体因为α-肽（β-半乳糖苷酶）保留完整，筛选平板中的X-gal（乳糖类似物）会被β-半乳糖苷酶水解，生成蓝色物质（5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo），故会产生蓝色菌落。如果载体含有插入片段，将会影响lacΖα序列的表达，影响α-肽的合成，进而导致X-gal不能被水解。因此，如果DNA片段已经插入载体，产生的菌落将是白色菌落。

2. 阳性筛选载体

简化筛选过程的一种有效方法是使用阳性筛选载体。和蓝白斑相似的是，其MCS区也是位于一段基因内，而该基因是一种条件性致死基因，比如在某些克隆菌种中表达一种限制性内切酶，该酶能够酶解掉宿主细菌的基因组DNA。

这样，当DNA片段插入到克隆位点后，致死基因的合成受阻。因此，只有携带重组质粒的细菌细胞才能生长。此方法大大节约了时间和成本，重组效率>99%。

3. 菌落PCR

菌落PCR（Colony PCR）是实验室用的最广的一种阳性克隆筛选方法。菌落PCR引物可以是插入片段特异性的引物、载体特异性的引物、或者二者都特异性的引物。

上图截取了pET28a载体的表达原件区域，其中包含常用的通用引物（T7,T7t），可以作为载体特异性引物，对于特定的插入片段还有其特异性引物（F,R）。使用T7和T7t引物进行菌落PCR，再通过PCR产物的长度来判断是否有片段的插入。但有时为了确定片段插入的方向，多将载体特异性的引物（T7）和插入片段特异性（R）的引物结合使用。

菌落PCR操作也很简单：先配制大体积的PCR预混液（例如200uL），在20uL分装9管（移液过程中有损失），给要筛选的菌落编号，分别用灭菌的牙签或者枪头等蘸一些菌加入PCR预混液中进行PCR扩增。菌落剩余部分培养于含相应抗生素的培养平板或LB培养基中，以便用于下游实验。

4. 限制性酶切检验

限制性酶切同样也能用于检验片段是否插入。首先，使用质粒小提试剂盒，从过夜培养的菌液中分离提取质粒DNA。使用DNAstar或者Snapgene等序列编辑工具，查找已知序列上的限制性酶切位点。选择出可以鉴定片段是否插入的合适酶切位点，之后使用限制性内切酶酶切经纯化的质粒DNA。酶切后进行凝胶电泳，检验酶切后的片段是否符合预期大小。

此方法需要摇菌、进行质粒小提、酶切、跑胶，程序繁琐成本太高，已经慢慢被小编淘汰了。

5. 测序

检测重组克隆最精确的方法是测序。不管你是通过蓝白斑筛选出来的白色克隆，还是菌落PCR筛选出来的阳性克隆，亦或是通过限制性酶切检验，最后都要通过测序来确定克隆是否正确。