pcr在各领域的应用（沃的实验）

PCR原理傻傻弄不清楚？

PCR实验步骤看似简单却总是做不好？

不知道不同实验目的该选哪种PCR？

「全线赋能“沃”的实验」之实验方法实战教程

直播第六期为大家讲解

《PCR技术》

从技术原理、步骤详解、类型介绍到应用领域

让你一场直播课吃透PCR

直播时间

7月5日（周二）19：00

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主题：PCR技术

• PCR的原理
• 实验步骤
• PCR的分类及实际应用

讲师：方晟

昆明理工大学硕士研究生，已发表SCI论文4篇，在载体构建、药物活性筛选、肿瘤模型构建、单细胞数据分析等方面有着丰富的经验，研究方向主要是抗肿瘤药物的抗癌机理和单细胞测序分析。

上期直播间互动问题

这次我们全部为小伙伴解答

Q1：如何去选择使用全脑缺血还是局部缺血模型呢？

A1：全脑缺血模型——二血管阻断法，模拟临床休克、心功能不全、脑血管严重狭窄或阻塞等血液低灌流引起的脑循环障碍；

全脑缺血模型——四血管阻断法，海马损伤明显，可显示记忆功能减退；

小鼠全脑缺血/再灌注模型——用于筛选脑活性保护成分或缺血性保护剂的研究；

局灶性脑缺血——栓塞法，适用于血栓形成过程研究及溶栓治疗观察，该方法可选材料多样，能较好模拟脑栓塞；

局灶性脑缺血——线栓法，急慢性局灶性缺血模型，模拟人类缺血性脑血管病的永久性及暂时性局灶性缺血的各种状态，较适合再灌注作用及相关药物疗效的探究；

局灶性脑缺血——光栓法，适合慢性脑缺血研究，抗血小板、抗血栓等药物及内皮细胞保护等方面的探究，该手术方法创伤小，动物可长时间存活，血栓形成过程与人类相似并且可选择皮层梗死位置；

局灶性脑缺血——开颅法，适用于脑缺血后长期神经功能缺损及介入治疗和康复的研究，此模型以大脑皮层、尾状核缺血最明显。

Q2：小鼠线栓造模选择什么规格的尼龙线？

A2：可以参考如下瑞沃德售卖的尼龙线规格

线径（尼龙线号）	总线长（mm）	规格	包装	动物体重（g）
0.10	30	MSMC19B100PK50	50根	15~20g小鼠
0.10	30	MSMC21B100PK50	50根	21~25g小鼠
0.12		MSMC21B120PK50	50根
0.10	30	MSMC23B100PK50	50根	26~30g小鼠
0.12		MSMC23B120PK50	50根
0.12	30	MSMC25B120PK50	50根	31~35g小鼠
0.15		MSMC25B150PK50	50根
0.15	30	MSMC26B150PK50	50根	＞35g小鼠

Q3：光栓造模光束的功率多少合适呢？

A3：

血管直径（μm）	激光波长（nm）	激光强度（W/cm2）	染料 （mg/kg体重）
10-40	458-488	0.2	黄素单核苷酸（37）
180-240	458	15	黄素单核苷酸（>37）
10-40	514.5	11	藻红B（35）
180-240	514.5	16	孟加拉玫瑰红（20）
700-1400	514.5	160	孟加拉玫瑰红（40）
700-1400	514.5	50	藻红B（35）
10-40	532	0.2-0.25	孟加拉玫瑰红（10）藻红B（12.5）
50-150	532	0.5-5.0	孟加拉玫瑰红（10）藻红B（12.5）
180-240	532	10.0-12.0	孟加拉玫瑰红（20）藻红B（25）
700-1400	532	130-180	孟加拉玫瑰红（20）藻红B（25）
10-40	562	0.25	孟加拉玫瑰红（10）
180-240	562	13	孟加拉玫瑰红（20）
700-1400	562	22	孟加拉玫瑰红（40）

Q4：MCAO模型成功的判定标准有哪些?

A4：可使用激光散斑血流成像系统或激光多普勒血流仪进行生理学检测，血流变化率＞70%即可初步判断模型成功，同步配合神经行为评分及TTC染色综合判定。

Q5：如何提高模型的存活率呢，有什么建议呢？

A5：（1）麻醉对死亡率影响较大，推荐使用吸入麻醉；

（2）控制缺血时间，缺血时间过长将导致死亡率的上升；

（3）维持术中及术后体温，可维持正常生理体征，推荐使用体温维持仪；

（4）可使用抗生素抗感染。

Q6：大鼠内皮素脑内注射诱导的局灶性脑缺血模型的操作及坐标点位置？

A6：（1）剪去动物颅顶的毛发，正中线向左旁开 0.2 cm行纵向切口，长约 1.5 cm。剪开皮肤，分离皮下筋膜，暴露颅骨表面，将颅骨骨膜刮除，骨膜处理的好处在于能够更清楚的观察骨缝，便于定位和固定，并有助于止血；

（2）将假电极移至 Bregma 点上，然后移动假电极至所需位置，并作好标记；

（3）移开假电极，在标记处用牙科钻钻一直径 1 mm 左右的小孔，以钻透硬脑膜为度；

（4）在颅骨其他部位钻两颗眼镜螺丝，深度不能超过颅骨厚度。将假电极换成 26-gauge（6.5 号注射针）的套管，按上述定位方法，将套管通过小孔下至硬脑膜，并以此位置为起始，向腹侧深入到脑的梨状皮质内 MCA 背侧 1～2 mm。该位点的参数为 Bregma 前 0.2 mm，外侧 5.2 mm，硬脑膜下 6.1 mm，或 Bregma 后 0.3 mm，外侧 5.6 mm，硬脑膜下 7.0 mm、

（5）用牙科水泥将套管固定于螺丝和颅骨上，5%聚维酮碘消毒创面。

Q7：在实验过程中分离了颈总动脉之后发现颈外动脉和颈内动脉是一上一下的，如何分辨这两个呢？

A7：颈内动脉看似在外，它从血管分叉处延伸出一小段就有向下走的趋势，基本没有侧枝；颈外动脉看似在内，相比颈内动脉表浅，侧枝较多。

Q8：脑缺血造模之后一般可以做什么行为学呢？

A8：

Q9：TTC染色不成功有哪些原因呢？

A9：可能性较多，包括了手术、试剂、染色注意事项、反面、PBS配置等等。如遇到TTC染色不成功，可以从以上各个方面去依次排除原因。

Q10：激光散斑血流成像系统的成像范围有多大，时间大概需要多久呢？

A10：成像范围是5.7mm*7.5mm-22.5cm*30cm，成像时间为0.01s/帧，全分辨率采样速度100FPS。

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