超分辨光学显微镜原理是什么（最高时空分辨率的荧光显微镜）

江苏激光联盟导读：

据悉，来自慕尼黑大学(LMU)和阿根廷布宜诺斯艾利斯大学的研究人员简化了MINFLUX显微镜，并成功地区分了非常相近的分子并跟踪其动态。该研究成果2021年12月18日发表在ACS Publications上。

在此几年前，光学显微镜中一个已知的基本分辨率极限被突破了，这一突破在2014年获得了超分辨率显微镜诺贝尔化学奖。从那时起，该领域又发生了一次本质上的飞跃，这进一步将分辨率极限降低到了分子水平(1 nm)。瑞典皇家科学院将2014年诺贝尔化学奖授予两名美国科学家和一名德国科学家。分别为美国科学家埃里克·白兹格(Eric Betzig)，德国科学家斯特凡·W·赫尔(Stefan W. Hell)，美国科学家威廉姆·艾斯科·莫尔纳尔(William E. Moerner)， 以表彰他们在超分辨率荧光显微技术领域取得的成绩 。

▲左：埃里克·白兹格，美国人，霍华德·休斯医学研究所的研究带头人。1960年生于美国密歇根州安娜堡，1988年获得美国康奈尔大学博士学位。中：斯特凡·W·赫尔，德国人，哥廷根马克斯普朗克生物物理化学研究所的主任，海德堡德国癌症研究中心的部门主任。1962年生于罗马尼亚阿拉德，1990年获得德国海德堡大学博士学位。右：W·E·莫尔纳尔，美国人，美国斯坦福大学应用物理系和化学系教授。1953年生于美国加州普利桑屯，1982年获得美国康奈尔大学博士学位。

超分辨率荧光显微技术(Super-resolution fluorescence microscopy)也称为远场荧光纳米显微技术，这项显微技术彻底改变了生物成像技术，因为它保留了荧光显微技术的优势，同时提供了亚衍射，理论上不受限制的空间分辨率。第一代超分辨率方法，包括扫描方法，例如STED(受激发射损耗, stimulated emission depletion)，和广域单分子定位显微镜(SMLM)方法，例如STORM和PALM，通常达到横向分辨率20-50nm的波长，受荧光团光稳定性的限制。在60-120 nm范围内，轴向分辨率通常会差2到3倍。最近，DNA-PAINT达到了小于10 nm的横向分辨率，部分克服了这一局限。具有这种分辨率水平的成像已经能够表征其自然状态下的亚细胞结构、纳米分辨率的环境以及超分子蛋白质结构。尽管如此，要达到荧光显微镜的最终分辨率，即荧光标记物的分子大小，还需要进一步提高分辨率极限。这是通过使用一种称为MINFLUX（最小发射FLUXes）的技术来实现的，一种结合结构化照明和单分子定位以最小的光子数提取单个分子的最大位置信息的新策略。MINFLUX可以在单个分子的成像和跟踪中常规提供约1 nm的定位精度。它已在模型系统（DNA折纸结构），固定和活细胞，中得到证明，并且最近扩展到三个维度。虽然MINFLUX代表了一项突破，但其由于其实验实施的技术复杂性高，因此减缓了广泛使用的速度。

在这里，研究人员介绍了脉冲交错式MINFLUX（p-MINFLUX），这是MINFLUX的一种新颖的实验实现，仅通过调整激励就可以在配备有时间相关单光子计数（TCSPC）检测的现有共焦显微镜中实现，不需要快速扫描光学器件或现场可编程门阵列（FPGA）电子器件。此外，与原始的MINFLUX相比，p-MINFLUX具有访问激发态寿命信息的附加优势，这是单分子光谱学中的一个相关参数，因为它可以实现单色测量的多路复用并提供有关荧光团环境及其与其他分子或材料的相互作用的信息。

图1. p-MINFLUX概念和实验系统的描述。

▲图解：（A）四个脉冲交错的甜甜圈形光束聚焦在以三角形图案排列的样品上，第四个光束位于三角形的中心。每个脉冲的到达时间表示为τi。位于激光光斑位置之间的单个荧光分子的位置由星号表示。（B）p-MINFLUX设置的示意图，详细说明了用于产生延迟了Δt的脉冲交错甜甜圈焦点的激励路径。（C）在原始激光源的一个周期（T）内检测到的光子计数的示意图信号。

Philip Tinnefeld教授（LMU）和Fernando Stefani教授（布宜诺斯艾利斯大学）领导的研究团队及时地插入了激光脉冲，以便它们可以以最大可能的速度在焦点位置之间切换。另外，通过使用快速电子设备，获得了皮秒范围内的时间分辨率，这对应于分子内的电子跃迁。换句话说，显微镜的极限仅取决于所用染料的荧光特性。

▲常规共聚焦显微镜（大）和使用p-MINFLUX的染料的荧光寿命

在该文中，科学家成功地证明了新的p-MINFLUX方法可以实现荧光寿命的局部分布（这是表征染料环境的最重要的测量变量），分辨率为1 nm。Philip Tinnefeld解释说：“使用p-MINFLUX，有可能在分子水平上揭示结构和动力学，这对于我们理解直至生物分子反应的能量转移过程至关重要。”

该项目由德国研究基金会（卓越电子转换集群，SFB1032），科学技术研究委员会（CONICET）和阿根廷国家研究，技术发展与创新机构（ANPCYT）资助。Stefani教授是亚历山大·冯·洪堡基金会（Alexander von Humboldt Foundation）的乔治·福斯特（Georg Forster）奖获得者，并担任慕尼黑LMU物理化学的定期客座科学家。

本文来源：Luciano A. Masullo et al. Pulsed Interleaved MINFLUX, Nano Letters (2020). DOI: 10.1021/acs.nanolett.0c04600