筛选分析关闭是漏斗原则吗 片段筛选中常犯的错误分析

An expert is a person who has made all the mistakes that can be made in a very narrow field. —— NielsBohr

前言

在药物发现技术领域里，唯一不变的就是不断地变化！不断革新的技术挑战旧有的方法，有些方法很快的出现、成熟，然后被抛弃。二十年前，高通量筛选技术的出现，很快主导了先导物发现领域，很多制药公司建立起了超过数百万个分子的化合物库，催生了很多新的先导物，尤其是对那些已知的药物靶点，然而该技术在对一些未知的或研究还不透彻的靶点来说，效率不高，经常会产生假阳性现象，或者得到的先导物存在很多问题。随着有机化学在新世纪的高速发展，估计具有类药性的小分子化合物数量约有1063亿个，超过了宇宙里星星的数量，数百万的化合物库对于这样庞大的数据来说，显得还是太过单薄！

图一 高通量筛选和片段化设计比较

由于高通量筛选存在的缺陷，基于片段的先导物发现技术(FBLD)被开发出来。FBLD采用了完全不同的策略，相比于高通量筛选数百万个药物大小分子量(重原子数一般在30左右)的化合物，FBLD以小分子化合物为起始点，通常分子量不超过300，重原子(非氢原子)数低于20，大约是药物分子量的一半，因此，具有成药性的片段化合物数量大大减少，Reymond课题组曾系统的计算过，对于含17个重原子的化合物，大约有1660亿个具有成药性的片段分子，和天文数字的类药性分子相比，算是一个比较能接受的数据，因此，对于FBLD技术来讲，只要有数千个片段的化合物库，就能开展先导物的发现试验，大大降低了先导物的发现难度和成本。在得到和靶点结合比较好的片段分子之后，通过对片段分子的不断修饰，得到期望的备选药物！在过去的近二十年里，基于片段的先导物发现技术(FBLD)在学术界和工业界得到了广泛的应用，并且硕果累累，超过二十个临床试验期药物的发现都是基础此项技术，FBLD技术获得了巨大的成功，目前已有有很多著作和文献做过FBLD的综述！

很明显，FBLD技术是能够有效地发现新的先导化合物，但是这个过程却不像想象中那么简单，会有很多的陷阱和困难存在。首先要面对的就是如何准确无误的得到能和靶点结合的化合物片段，因为片段通常和靶点的结合力都很弱，需要有很灵敏且可靠的检测方式才行！

图二 片段筛选技术

1996年，雅培公司的研究者证明了蛋白质探测NMR技术不仅可以探测到很低的片段与蛋白结合作用，还能发现片段连接方式，如今更多的探测方式被开发出来(图二)，如表面等离子体共振技术(SPR)、配体核磁共振探测(NMR)、热力学位移法等(Ts)。不同的方法有各自的优点和缺陷，对于一个经验丰富的药物设计专家来说，他能综合各种技术的优缺点，准确地从噪声中检出信号峰，从而得到真正有用的片段。而对于新手来说，很容易会被噪声峰干扰，得出错误的结论，产生假阳性的结果。更有甚者，研究者自己都未意识到判断出错，结果发表了错误的数据，而其他跟进者所做的工作，要么不能重现，要么也得到了错误的结论。

在片段化合物的发现过程中，每一步都可能出现错误，总体上可分为两类：一类是片段化合物造成的，还有一类是检测方式产生的。

1.化合物造成的误差

①正确的化合物

首先，要保证所用的化合物是正确的！虽然这个问题看起来太低级，但很多研究者都遇到过。产生这种错误的原因可能是化合物在数据库注册时出错，也有可能是供应商出错，造成拿到的化合物并不是期望使用的结构，这样一般会产生两种结果：第一、运气好，初步的筛选成功了，但是后续的化学修饰总是失败；第二、带着错误一路成功下去，但是始终用着错误的结构。这样的错误真实发生过，如很多研究者发现，他们从供应商那里买到的伯舒替尼其实只是错误的异构体。

②纯度问题

通常片段筛选时的浓度都比较高，因此，即使小量的活性杂质也会对结果产生非常大的影响。以1mM的浓度进行筛选，假若含有1%的杂质，那么杂质的浓度也会达到1uM。一般的杂质可以通过NMR和HPLC-MS检测，但是合成过程中引入的金属杂质用上述方法是无法发现的！银、锌、钛、钯等是合成化学中常用的金属试剂，这些残留的金属杂质经常会造成假阳性结果，因此，在进行片段筛选时，一定要注意化合物是否达到合格纯度。

图三 发生降解的片段化合物

③稳定性问题

一般药物化学家都会尽量制备出能够在外部稳定储存的化合物作为备选片段，由于不当的存储方式，某些化合物还是会发生降解反应，其中一个原因就是常用溶剂DMSO造成的。DMSO具有温和的氧化性，嘧啶类衍生物在DMSO中就很容易发生降解反应。另外一个原因就是水！DMSO是一种吸湿性溶剂，在储存时发生冰冻-溶解循环，导致某些化合物会发生水解反应。除了上述两个原因外，光照、pH、溶液状态等都可能导致化合物发生降解反应，因此在进行片段筛选的时候要关注所用化合物的稳定性如何，如果不稳定就修改实验方案。

图四 可形成共价键结合的官能团

④反应活性化合物

有些化合物在体外是稳定的，可以长期储存，但是具有较高的化学反应活性，容易和生物靶点生成共价键，形成不可逆的结合。当然了，有很多药物是采用这种设计策略，对于非共价键结合药物的设计时，要避免这些具有高度反应活性的官能团(图四)，但对于共价键结合药物的设计时，必须要仔细设计，高度反应活性容易引起严重的副反应，导致造成后期的开发的失败。

图五 容易产生假阳性的结构

⑤假阳性化合物

大多数经验丰富的药物化学家在看到具有这些官能团的分子时(图五)，都会非常小心。当然了，并不是所有看起来有问题的分子都会产生真正的问题，产生假阳性的化合物通常都会含有迈克受体结构，而蛋白质的氨基酸残基中多含有亲核部分，两者容易发生反应，或许也会有非共价结合作用，但这种共价结合作用会极大地干扰实验结果。此外这些结构也容易产生假阳性结果(图五)，很不幸的是，此类化合物商业易得，很多化合物库中都含有，而且经常表现出非常好的效果，有些研究者并不了解这些化合物本身具有的干扰性，发表的数据误导了很多人。

图六 氧化还原活性分子

⑥氧化还原活性分子

有些化合物具有氧化还原循环特性，通常含有多个氮原子，在缓冲剂DTT或TCEP的作用下生成活性中间体，同时被空气氧化，产生过氧化氢，进而氧化蛋白质，尤其是半胱氨酸残基部分，但是这种机理很多人并不清楚，导致假阳性结果。如化合物11(图七)，最初认为是一个蛋白-蛋白相互作用抑制剂，在后续的平行构效关系研究中，发现该化合物在缓冲剂DTT的作用下发生氧化-还原循环，产生过氧化氢造成阳性结果。

图七 易聚合化合物

⑧易聚合化合物

有些化合物在体外能够稳定存在，且不存在高反应活性官能团，也可能会造成假阳性结果(图八示例)，主要造成的原因是在缓冲溶液中产生了聚合现象，聚合生成的粒子能够抑制很多不同种类的靶点，造成假阳性结果。聚合作用的发生和浓度密切相关，浓度越高，聚合作用越明显，在进行片段筛选时呈现浓度正相关的阳性结果。因此在进行片段筛选时，要确定化合物是稳定的、不会发生聚合作用。

2.测试方式造成的误差

除了片段化合物造成的错误结果外，不同的测试手段也有自身的优势和缺陷(如表一)，因此，对于一个可能的有效的片段化合物，需要通过多种不同的测试手段，确定其效果。例如通过核磁共振和表面等离子体共振两种手段会得到很多有效片段化合物，可两种测试方式都显阳性的化合物可能寥寥无几，而晶体学测试后发现，没有一个是有效的！

表一 各种筛选方法比较

①核磁共振检测法

核磁共振测试配体-蛋白相互作用是最早应用于片段化设计策略的检测方式，可靠性和有效性都很不错，但是仍然也有自身的缺陷。采用NMR检测时，配体的数量是远远大于靶点蛋白的，如果配体从蛋白上解离的速率很慢，其净效果就会很弱，甚至探测不到有结合的现象，造成假阴性结果！在实践中，表现为低浓度的结合效率比高浓度的结合效率还要好些。另外，某些片段化合物溶液可能显酸性或者碱性，会导致pH的变化，也会引起蛋白化学位移的变动，干扰实验结果。

②X射线晶体学

有图有真相，再多的语言描述，也比不过一张漂亮的单晶衍射照片！晶体数据被认为是黄金标准：通过晶体可以得知配体是如何和靶点相互作用，能够给下一步化合物的修饰提供重要指导意义。但是我们都忽略的一点是：再漂亮的分子模型也只是一个模型而已，显示的只是一个单一的静态结构，并不能完全体现蛋白与配体在溶液中的相互作用关系，而且，有些时候会误把缓冲物质或溶剂错认为配体片段。最大的问题在于，由于蛋白-配体晶体培养时用了很高浓度的配体，所以拿到的晶体结构或许只是配体和蛋白的共结晶产物！而且，并不是所有的配体都能够和蛋白形成可以用于测试的单晶结构，这也限制了X射线晶体法在片段筛选中的应用。

③等温滴定量热法(ITC)

ITC测量可以提供配体-蛋白的结合热力学参数(ΔG, ΔH,ΔS)，在精确操作的前提下，这个方法是非常有效和可靠的，但该方法容易受到系统误差的影响，如不正确的测试浓度和不能合适计量的稀释热等。对于同样的测试项目，不同实验室可能会给出不同的测试结果，ITC方法还需要进一步的发展。

④表面等离子体共振法(SPR)

目前SPR技术在片段发现领域占支配地位(图二)！首先把蛋白负载在一张芯片上，然后让不同浓度的小分子化合物溶液流过，当配体和蛋白结合后，会导致配体质量和蛋白质量的变化，通过检测这种微小的比例变化寻找配体。SPR技术容易操作，但想要得到稳定可靠的数据，有很多需要注意的地方，聚合作用是影响SPR技术的一个因素，会导致出现SPR信号，对于缺乏经验的研究者会误以为是配体结合到了蛋白上。再比如负电性蛋白会吸附正电性的配体，而这种吸附作用是没有特异性的，也会出现假阳性结果！

⑤热位移法

热位移法是指将配体和蛋白混合之后加热，然后测量蛋白质的“溶解温度”，通常配体能够稳定蛋白质，如果发现“溶解温度”升高，就意味着该配体能够和蛋白结合，这种方法简单有效而且便宜，在片段筛选上运用很广泛。

结语

在片段筛选的过程，每一步都可能得到错误的信息，了解这些可能存在的原因能够避免重复别人的错误，提高开发效率，同时也能够避免不必要的资源浪费！

参考文献：

1.Davis，Ben，and Daniel A. Erlanson. 'Learning from our mistakes: The 'unknown knowns' in fragment screening.' Bioorganic& Medicinal Chemistry Letters 23.10 (2013): 2844-2852.

2.Erlanson，Daniel A，etal. 'Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery..' Nature Reviews Drug Discovery 15.9 (2016): 605-619.

3.Baell，Jonathan B..'Broad coverage of commercially available lead-like screening space with fewer than 350,000 compounds.' Journal of Chemical Information and Modeling 53.1 (2013): 39-55.

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