6470液相色谱串联质谱作业指导书（6470液相色谱串联质谱作业指导书）

安捷伦1290/6470液相色谱串联质谱作业指导书

1 辅助系统检查：

1.1 打开稳压电源。

1.2 打开蓄电池开关。

1.3 打开氮气发生器电源，待压力输出稳定后，调节输出压力约为0.7MPa，并确认前级泵的镇气阀处于关闭状态。

1.4打开高纯氮主阀门，调节高纯氮气钢瓶次级减压表输出压力至0.15Mpa（最大不要超过0.2MPa）。

1.5配置流动相，过膜超声后使用。

2 开机

2.1 打开计算计，网络交换机（LAN Switch）电源。

2.2 打开Agilent 1290各模块电源。

2.3 打开质谱前面左下角的电源开关，这时可以听到质谱里面溶剂切换阀切换的声音。同时机械泵开始工作，仪器开始自检。等待大约两分钟，听到第二声溶剂阀切换的声音（表明质谱自检完成）后，表示仪器自检完成，可以联机。质谱一接通电源，前级真空规就开始工作，监视前级真空值。但只有当Turbo1和Turbo2涡轮泵的转速都大于95%，四级杆的高真空规才会开始工作，正常读取真空值。

2.4在计算机桌面上双击MassHunter采集软件图标

，进入MassHunter工作站。

3 开启工作站

显示如下画面。

3.1 泵排气泡，选择二元泵模块，单击鼠标右键弹出快速控制仪器的菜单，选择“Prepare Pump”显示如下画面。

3.1.1点击“Start”按钮，二元泵开始工作，排A相管路气泡。等5min后，泵停止工作在Composition右侧空白框中输入100，点击“Start”按钮，泵开始排B相管路气泡。

1. 新建仪器进样方法：点击左下角”Method Editor”，在此处编辑所有LC和QQQ的方法参数。

4.1液相参数设置

4.1.1自动进样器方法的设置

在方法编辑界面可以设置进样方式，进样体积等。为了减少交叉污染和降低进样残留，进样方式一般选择洗针进样。洗针方式可以使用某个固定位置的样品瓶（Wash Vial）,也可以使用清洗端口洗针（Flush Port）。相对来说使用清洗端口可以取得更好的洗针效果。一般选择这种模式，清洗时间3-10秒钟就足够了。

如果在样品信息或者工作列表中设置了进样体积，那么这里设置的进样量会被忽略，而采用样品信息或者工作列表中的设置。

取样位置可以调整进样针的插入位置，默认为零。使用标准样品瓶时针尖距离瓶底的距离约为2mm。当样品量比较多并且担心有沉淀的时候，可以选择把针的位置抬高。

当样品量很少时，也可以考虑把针的位置降低（最多比默认位置降低2.5mm）。

注意：如果设置降低针的位置的时候，请特别小心操作，每个自动进样器可以降低的数值是不一样的。防止进样针降得过低扎坏样品瓶，损坏进样针和自动进样器。

4.1.2二元泵的参数设置

在泵的参数设置界面可以设置泵的流量、流动相比例、数据停止采集时间等。下图是一个带有溶剂选择阀的二元泵设置界面，它有两个A通道和两个B通道。带有溶剂选择阀的二元泵给用户提供了更多的功能选择，可以选择使用A1-B1、A1-B2、A2-B1以及A2-B2四种溶剂组合方式，但是，不能同时使用A1-A2或者B1-B2。

仪器在后运行时间内并不采集数据。此时，流动相比例和流速会回到方法起始的流动相比例和流速，然后会继续冲洗这里设定的后运行时间后，才会继续进下一针样品。因而适合用在含有梯度洗脱的方法中平衡色谱柱。

对于高压二元泵，请在下拉列表中选择相应溶剂瓶中的溶剂种类。溶剂类型决定该通道的压缩因子；压缩因子是指当给溶剂施加压力时，该溶剂可以被压缩的程度。压缩因子越大，说明该溶剂越容易被压缩。压缩因子的正确设置对于二元泵能否精密准确工作非常重要。

在Advanced选项下可以泵的最小冲程，溶剂的压缩因子等。如没有特殊情况，冲程一般都设成使用Automatic。对于Mixer的选择会影响ISET的可靠性。

ISET：ISET（Intelligent System Emulation Technology）,用户可以使用现有的1290系统，模拟其他液相的延迟体积及混合行为，可以得到和其他液相相识的色谱结果。

4.1.3柱温箱参数设置

这里可以设置柱温箱的控制温度，可以选定某一温度或者不控制。大部分应用情况下，左右加热的温度设置成相同值（即右加热块选择Combined）。

4.2三重四级杆采集参数的设定

4.2.1调谐文件选择、时间过滤和时间分段等设定

在MS三重四级杆参数画面，我们首先介绍左侧的设置。

缺省的调谐文件为atunes.Tune.xml，如果没有必要，不要改动。但是我们也可以点击Browse按钮调用任何一次调谐文件。如果点击

按钮则会显示当前调用调谐文件的所有参数。

离子源选择必须与实际安装的类型一致，否则仪器会显示Ion Source not identical,无法工作。

时间过滤（Time Filtering）实际是一种色谱图的平滑处理选项。如果不选择此复选框，则对色谱图不会进行任何的平滑。如果使用此选项，那么峰宽（Peak Width）的设置最大值为样品的最窄色谱峰的半峰宽，超出就会出现数据采集丟峰的情况。使用此复选框的时候，软件自动每11个数据点进行一次高斯平滑。

时间段（Time Segments）,如果同时分析多种化合物，可以根据保留时间不同划分成若干个时间段。与不分段相比，每个时间段内采集的离子个数减少，则采样周期缩短，有助于提高仪器灵敏度。每个时间段可以采用不同的极性模式。每个时间段LC流出的流动相也可以选择不同的处理方式，即可以切换到质谱，也可以切换到废液（Div Valve选项）每个时间段可以选择保存数据，也可以选择不保存数据（Store选项）。

右键在时间段区域点击可以弹出菜单选择增加或删除时间段。

Delta EMV（ ）、Delta EMV（-）分别为正、负离子模式下，在调谐的EMV的基础上增加的电压数值。在一定范围内，增加Delta EMV可以提高灵敏度和信噪比。每个时间段可以设置不同的值。

注意:在满足检测灵敏度要求的前提下，Delta EMV的数值越小越好，越小越有利于延长电子倍增器的寿命。一般使用200-400V。Delta EMV设置的越高，电子倍增器的寿命越短。

4.2.2多重反应监测（MRM）采集模式的参数设置

MS1采用SIM方式选择某个或多个质荷比的母离子，在碰撞池施加碰撞能量产生碎片离子。MS2同样采用SIM方式来监测由母离子产生的一个或几个特定子离子。这就是多重反应监测（MRM）。这种方式可以极大提高检测器灵敏度和准确性。是三重四级杆仪器最主要的使用方式。

在下拉列表中选择MRM。当分析化合物的种类较多和复杂时，可以根据化合物的保留时间划分成若干个时间段。这样每个时间段内采集的离子个数减少，则采样周期缩短，有助于提高仪器灵敏度。

每个化合物需要设定其母离子以及定量子离子，还可以进一步设定一个或几个定性子离子，来进一步增强检测的特异性，减少假阳性。

对于同一个化合物，其不同子离子的最优碰撞能量可能不同，需要在方法开发时进行优化。

每个扫描段的不同离子可以设置不同的极性。不同极性的离子，推荐设置在不同的时间段内进行检测。一般情况下不建议同一个时间段内采集不同的极性，否则设置不当有可能增加噪音，降低检测的灵敏度、准确性和重现性。

4.2.3带有安捷伦喷射流技术的ESI源的参数设置

与普通ESI源相比，带有安捷伦喷射流技术的ESI源增加了Sheath Gas Temp、Sheath Gas Flow和Nozzle Voltage参数。

Jet Stream 推荐的起始条件如下：

一般HPLC的流速在250-600ul/min之间时，仪器可以达到最佳的灵敏度。

对灵敏度影响由大到小依次是：鞘气的温度和流速，喷嘴电压，雾化器压力，毛细管电压，干燥气温度和流速。

4.3方法属性

可以设置方法前运行和后运行的动作，以及给方法添加一些说明和描述。

4.4保存方法

在Method Editor页面下点击 可以保存当前方法，点击 可以把方法另存为其他名字。

4.5编辑和运行Worklist

工作列表（Worklist）是自动进行样品分析的一系列指令。使用工作列表，可对多个样品实现自动分析进样。

4.5.1创建工作列表

点击进入Worklist页面，会显示当前打开的Worklist。

工作列表面板点击右键，通过弹出的菜单可以实现添加单个或多个样品，复制，插入等功能。这和通过Worklist菜单能实现的功能相同。

在Worklist处点击右键，从弹出的菜单选择Show/Hide/Order Columns,我们就可以在弹出的窗口增加或减少在Worklist表格里面显示的内容，比如，我们可以增加Inj Vol(ul)进样体积项。

4.5.2往工作列表添加一个样品

从Worklist菜单中选择Add Sample，工作列表表格就添加了一个新的样品。我们可以接在工作列表表格输入以下样品信息：样品名称，样品位置，方法，数据文件名称，样品类型，进样体积，备注和级别名称等。

4.5.3往工作列表添加多个样品

在工作面板点右键或从Worklist菜单选择Add Multiple Samples。在Sample Information选项卡下，填写样品名称，数据文件名称，调用方法，方法路径以及数据文件储存路径等。点击sample Position选项卡，选择要添加的样品所放置的位置。

点击并拖动鼠标来确定一个邻近的区域；在键盘上按住Ctrl点击并拖动鼠标，可以选择其不相邻的位置的样品；使用键盘的Ctrl Shift键可以在不同位置选择多个样品。

点击OK关闭Add Multiple Samples对话框。设定的样品出现在Worklist表格，并且可以进行再次编辑。

4.5.3设置工作列表完成后自动待机

从Worklist菜单选择Worklist Run Parameters...,设定工作列表的运行信息，方法路径以及数据文件储存路径等。勾选Post worklist,点击

快捷按钮，在弹出的窗口选择SCP-InstrumentStandby,这个Script的功能是使得Worklist在运行完毕后自动切换到Standby。

这个功能也可以在Worklist的最后一行点击右键，选择Add Script....，在弹出的窗口选择SCP-InstrumentStandby。

4.5.4保存和运行工作列表

在Worklist页面下点击 可以保存当前Worklist,点击 可以把Worklist另存为其他名字。

在Worklist页面下点击

按钮，或者点击工具栏上的 快捷按钮，开始运行工作列表。

在工作列表运行过程中，可以继续编辑和增加样品，也可以删除样品，或者通过样品的复选框决定是否取消某个样品的运行。

在工作列表运行过程中，可以点击Worklist页面或工具栏上的

按钮停止工作列表的运行。

也可以点击Worklist页面或工具栏上的

按钮，暂停工作列表的运行。再次点击此按钮则可以恢复Worklist的运行。

4.6定性分析

双击Agilent Masshunter Qualitative Analysis图标，打开定性分析软件。

4.6.1定性软件的主要功能区和常用快捷键。

定性软件的主要功能区常用快捷键和介绍如下。

在定性分析软件内，各个窗口可以任意拖动排列。如果需要默认窗口设置界面，可以通过Configuration菜单栏上单击Windows Layoutda＞Restore Default Layout来操作。

打开定性分析软件时会自动弹出Open Data Flie对话框，选中待分析的数据文件，单击Open按钮，即可打开。此对话框也可以通过直接点击菜单栏上打开数据文件的快捷按钮实现。

在定性分析软件内，打开一个新数据时，原来打开的数据并不会关闭，而是会顺序排列在数据浏览区内。如果需要关闭某些数据的话，可以点击关闭数据的快捷按钮，选择要关闭的数据即可。

4.6.2放大或缩小谱图

要放大或缩小X轴，请将光标移到X轴下方直到出现水平双箭头

。按住鼠标右键并从左向右拖动，则X轴放大；按住鼠标右键并从右向左拖动，则X轴缩小。

要放大Y轴，请将光标移到Y轴左侧直到出现垂直双箭头

。按住鼠标右键并从下向上拖动，则Y轴放大；按住鼠标右键并从上向下拖动，则Y轴缩小。

单击

图标完全缩小Y轴。

单击

图标同时完全缩小X轴和Y轴。

这个功能在定性、定量软件的所有窗口都适用。不仅适用于色谱图，也适用于质谱图。按住鼠标右键拖动可以放大或缩小；按住鼠标左键拖动则是坐标平移。

注意：另外一个放大的方法是在色谱图或质谱图内按住并拖动右键选择一个区域，则该区域被放大。

4.6.3提取色谱图

右键点击数据导航区选择的数据，或者在色谱图显示区域点击右键，在弹出的菜单选择Extract Chromatograms。

比如要提取EIC，则在下图中的Type下拉选择EIC，在m/z Values(s)处输入要提取的质量数，点击OK按钮即可。如果要同时提取多个不同质量的色谱图，则可以输入多个数值，以逗号分开。还可以提取一段质量范围的色谱，比如可以输入278-281这样一段质量范围。在同时提取多个色谱图时，如果选中Merge Multiple masses into one chromatogram,则提出的所有色谱图会自动合并显示在同一个窗口内。如果不选择该项的话，则会分别显示在独立的窗口内。

4.6.4提取质谱图

在色谱图窗口，首先确认高亮

按钮。如果要提取某点的质谱图，直接在该点双击左键即可。如果要得到某时间段的平均质谱图，可以在TIC图上按住鼠标左键并拖拉鼠标，选择一段范围，然后在选中的区域双击鼠标左键即可。或者在选中的区域点击鼠标右键，从弹出的菜单选择Extract Spectrum,也可以得到选择的这段时间的平均质谱图。

对于不想要的色谱图或质谱图，可以用鼠标点击选中它，按键盘上的Delete键即可删除；或者直接在相应窗口内右键点击，在弹出的菜单选择Delete即可。

这时，软件会弹出一个窗口提示Delete all highlighted items?,如果点击Yes按钮，所有被选中的谱图都会被删除。如果选择了Do not show this message box again,那么以后在删除谱图的时候，不再提示即直接删除。

4.6.5提取和扣除质谱背景

在TIC图使用选择范围工具

选择某点或一段背景范围，单击鼠标右键，选择Extract Spectrum to Background,该质谱图被自动加入到背景质谱图（Background Spectra）。

在MS Spectrum Results 内的某张质谱图上右键点击，在弹出的窗口选择Substract Background Spectrum.则该质谱图会自动扣除上面的背景质谱图，

若要把已有的某张质谱图作为背景来扣除的话，可以直接选中该质谱图，然后点击右键，在弹出的菜单选择Move to Background Spectrum。那么该质谱图就会被放入Background Spectra,可以被其他的质谱图作为背景来扣除了。

4.7定量分析

双击桌面上的三重四级杆定量分析软件图标，运行定量软件。单击工具栏上“Restore Default Layout”按钮确认主画面恢复为缺省布局。

4.7.1内标法定量（ISTD）

单击菜单项File＞New Batch：

在新的批处理对话框，找到数据文件夹，例如“D：\Masshunter\Demo Data\DrugOfAbuse”,输入批处理文件名，例如“qqq”并点击Open按钮创建一个新的批处理文件：

软件自动弹出Add Sample对话框，单击选择Select All按钮然后单击OK来添加所有样品：

单击菜单Method＞New＞New Method from Acquired MRM Data

用鼠标选择CMAMCal-L5.d并点击Open按钮导入MRM方法采集信息（此处需要选择最优代表性的谱图，一般选择高浓度样品数据，这样保留时间，离子比例等比较准确）：

在左侧Method Setup Tasks选项下自上而下进行，首先点击MRM Compound Setup检查导入的用于MRM化合物设置的采集参数是否正确。

单击方法设置任务Method Setup Tasks＞Retention Time Setup,检查确认导入的参数。

单击方法设置任务Method Setup Tasks＞ISTD Setup，然后从下拉菜单ISTD CompoundName为每个目标化合物指定内标化合物（ISTD），ISTD Conc列输入相应内标化合物的加入浓度。

本例中每种化合物均以其氘代产物作为内标。

单击方法设置任务Method Setup Tasks＞Concentration Setup,

单击Method方法菜单选择“Create Levers from Calibration Samples”

填写各级别校正样品的浓度，

单击Method方法菜单选择Copy Calibration Levels To...在复制校正级别对话框，单击选择所有（Select All）对话框，然后单击OK按钮。

浏览方法表（Method Table）比较四个目标化合物“Amp”，“Cocaine”,“Meth”和“MSDA”的校正浓度设置。

单击方法设置任务Method Setup Tasks＞Qualifier Setup,检查定性离子设置（Qualifier Setup）参数，在导入MRM方法采集参数时定性离子参数自动产生。

单击方法设置任务-校正曲线设置Method Setup Tasks＞Calibration Curve Setup,检查每个目标化合物曲线拟合（Curve Fit）的缺省设置：

单击Save/Exit＞Validate验证方法设置，如果有错误提示，请按照提示进行改正并重新Validate。直到软件提示：Method validated No errors or warnings found.

单击Exit,然后选择Analyze，最后点Yes应用方法到此批处理表

软件会自动分析批数据。检查批处理分析结果，化合物信息和校正曲线显示在分析结果的下部。这个表格可以通过菜单File＞Export导出成Excel文件。

点击File＞Save Batch,保存批处理。如果需要关闭，点击File＞Close关闭批处理。要产生定量报告，单击Report＞Generate

在Generate Report界面，选择New，建立新报告方法（如果已有报告方法，直接选择Choose）,

选择Add Template

选择报告模板

选择生成报告的格式，点Save&Exit,

选择保存路径，点SAve，保存报告方法。

选择生成报告的路径，点OK，生成报告。

在指定目录下，找到QuantReports文件夹按照Batch名称找到新产生的Excel报告。可以双击打开查看。

4.7.2外标法定量（ESTD）

外标法定量的步骤与内标法定量相似，所有与内标物设定相关的选项，都保持默认值，

1. 关机

5.1在MassHunter采集软件内点击三重四级杆MS的图标，依据下图所示选择Vent。

5.2出现下述提示，如果确认要放空，选择Yes。

5.3可以在三重四级杆Method的Diagnosis界面观察涡轮泵转速的下降情况。

5.4分子涡轮泵转速和功率基本为0后，等待30分钟，关闭MassHunter软件。然后关闭质谱及LC各模块，PC电源。

5.5关闭UPS电源：关闭UPS电源开关。

5.6做好使用记录。

注意事项

如果长时间关机的话请拔掉质谱主电源线。

6、仪器校检周期为一年

7仪器的日常维护

7.1 MS维护周期表

下表是安捷伦建议的维护周期。

注意：实际的更换维护频次应该考虑实际的使用情况而定。

8 期间核查

液相色谱串联质谱仪器校检合格后，至下一次校准期间，要对仪器进行一次期间核查。

8.1 配制1ug/L的利血平标准溶液进行重复性测量8次，看重复性误差RSD%≤3%。

8.2 检测完毕给出期间核查报告，对此次测量作出评价。

,