pcr技术引物设计原则(Real-TimePCR引物设计案例实操版)

pcr技术引物设计原则(Real-TimePCR引物设计案例实操版)(1)

作者:阳光

引物设计道理听了很多,依然做不好一个引物设计?你需要的是实战演习!废话不多说,案例搬上来:

引物设计具体操作,以设计TP53引物为例

1)首先在NCBI中输入基因

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pcr技术引物设计原则(Real-TimePCR引物设计案例实操版)(3)

3)找到该基因的mRNA序列

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pcr技术引物设计原则(Real-TimePCR引物设计案例实操版)(5)

5)点击Pick Primer,进入引物设计界面,系统自动把该基因的序列输入到了里面,也可以把你任何想要设计引物的序列输入到对应的框中,设计针对该序列的引物

pcr技术引物设计原则(Real-TimePCR引物设计案例实操版)(6)

6)将扩增产物大小设置为100-150

pcr技术引物设计原则(Real-TimePCR引物设计案例实操版)(7)

7)点击下方的Get Primer

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8)选择并提交

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9)提交后即可得到引物序列

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10)根据引物设计的原则筛选合适的引物

引物设计原则

1)扩增产物长度100 bp-150 bp为佳;

2)引物长度17 bp-25 bp最好;

3)正向引物和反向引物的Tm值最好相差不要超过1℃。Tm值调整至60℃-65℃为佳;

4)引物的GC含量控制在40%-60%之间,最佳为45%-55%;

5)引物3'末端碱基最好为G或C或A,避免使用T;

6)避开引物内部或者两条引物之间有3个碱基以上的互补序列,二条引物之间的3'端避开有2个碱基以上的互补序列;

7)引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀,避免使用GC或者TA含量高的区域,尤其是3'端,必须避开GC含量不均匀的区域;

8)最好跨内含子设计引物。

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